Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 84

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 191 >> Следующая

лежала в интервале, указанном ниже:
а) фосфолнпаза С - от 1 до 10 ед/мл;
б) фосфолнпаза А - от 0,5 до 5 ед/мл;
в) фосфолнпаза D - от 1 до 10 ед/мл.
Скорость гидролиза зависит от концентрации фосфолипазы. При изучении
процессов, протекающих с быстрым установлением равновесия (например, в
экспериментах с радиоактивной меткой), фосфолипазу следует брать в
высокой концентрации, сократив время инкубации. Объем инкубационной смеси
может быть разным в зависимости от количества имеющегося мембранного
белка. При исследовании микросом печени крысы обычно берут 5 мг белка в
1,0 мл, тогда как при исследовании мембран аппарата Гольджи приходится
использовать 0,5 мг мембранного белка в объеме 0,1 мл.
4. Инкубируют мембраны в присутствии фосфолипазы и без нее. Останавливают
реакцию добавлением смеси хлороформ/метанол (2:1) вместе с ЭДТА (10 мМ),
которая хелатирует ионы кальция и предотвращает дальнейшее действие
фосфолипазы С в ходе экстракции.
5. Экстрагируют липиды, как описано ранее, и определяют общее содержание
липидного фосфора в пробах липидного экстракта. Если в качестве зонда
использовалась фосфолнпаза С, то степень гидролиза рассчитывают по
формуле
jqq Липидный фосфор в мембранах, обработанных фосфолипазой
Липидный фосфор в мембранах, ннкубироваииых без фосфолипазы
Степень гидролиза индивидуальных липидов определяют после разделения
основных классов фосфолипидов с помощью ТСХ. Для этого соскабливают
силикагель, содержащий фосфолипиды, и определяют степень гидролиза
каждого липида, как и в случае общего гидролиза.
Если в качестве зонда используют фосфолипазу А, то количество общего
липидного фосфора остается прежним, поскольку продуктами гидролиза
являются лизофосфолипиды. Для определения степени гидролиза под действием
фосфолипазы А необходимо разделить фосфолипиды с помощью двумерной ТСХ.
Можно также использовать одномерную хроматографию для
186
Глава 4
разделения основных классов фосфолипидов и определить степень их
гидролиза путем сравнения с контрольными образцами, проинкубированными
без фосфолипазы А.
С помощью предварительных экспериментов следует определить временной ход
процесса гидролиза суммарных мембранных фосфолипидов. Эта зависимость
должна выходить на плато при степени гидролиза около 50%, но конкретная
цифра может зависеть от используемой фосфолипазы, поскольку не все
фосфолипиды, содержащиеся в мембране, являются для нее субстратами. Кроме
того, фосфолипиды могут располагаться в мембранном бислое асимметрично.
Гидролиз фосфолипидов в микросомах выходит на плато при 50% через 5 мин
при концентрации фосфолипазы С 10 ед./мл и через 15 мин при концентрации
1 ед./мл.
По данным, полученным в ходе этих экспериментов, можно рассчитать степень
расщепления каждого мембранного фосфолипида при выходе гидролиза на
плато; это отвечает содержанию данного фосфолипида на наружной
поверхности бислоя.
Чтобы показать, что полученные результаты не обусловлены субстратной
специфичностью использованной фосфолипазы, мембранные везикулы следует
сделать проницаемыми с помощью одного из описанных выше методов и затем
проинкубировать с фосфолипазой. Если тот или иной фосфолипид
действительно расположен на наружной стороне мембраны, он должен
полностью гидролизоваться в незамкнутых везикулах. Если же фосфолипид не
гидролизуется ни в случае открытых, ни в случае замкнутых везикул, то
сказать о его топологической локализации ничего нельзя, и для определения
его трансмембранного распределения следует использовать другие зонды.
7. Выяснение трансмембранного распределения фосфолипидов с помощью
химических модифицирующих реагентов
7.1. Принцип метода
Мембранные везикулы инкубируют с химическим модифицирующим реагентом и
определяют долю фосфолипида, вступившего в реакцию. Выбор химических
реагентов для фосфолипидов не так богат, как для белков (см. гл. 6); они
применяются главным образом для модификации аминофосфолипидов -
фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина. Список реагентов, которые
использовались с этой целью, включает метилфос-фат формилметионина,
динитрофторбензол и тринитробензол-сульфокислоту (ТНБС). Применение
любого из этих реагентов оправдано только при условии соблюдения
указанного выше требования: реагент не должен сам проникать через
мембрану
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
187
н нарушать ее целостность. Ниже описана методика модификации микросом
ТНБС. Этот реагент чаще других использовался для определения
топологического распределения аминофосфоли-пидов в плазматических
мембранах целых клеток, а также в ряде субклеточных мембранных
препаратов.
7.2. Методика
1. Ресуспендируют мнкросомы (1 -12 мг по белку) в 5 мл 280 мМ
маннитольного буфера (pH 7,4), содержащего 70 мМ сахарозу, 40 мМ
бикарбонат натрия, 1 мМ MgCl2 и 2 мМ сук-цннат. pH буфера имеет большое
значение, поскольку при pH>8,5 мнкросомные везикулы становятся
проницаемыми, и ТНБС попадает внутрь них.
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed