Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
10 раз ниже, чем иммуносорбента на основе целлюлозы, однако сама
процедура тестирования более удобна. Когда антиген в достаточной степени
очищен и может быть помечен радиоизотопами, любой из названных методов
иммобилизации можно использовать в простом тесте связывания антигена (для
выбора подходящего варианта теста см. табл. 3.3,5). Если есть
118
Глава 3
Таблица 3.2. Приготовление целлюлозных иммуносорбентов
А. Приготовление "аминоцеллюлозы"
1. Растворяют 0,5 г ацетата натрия в 2 мл воды, а 1,4 г ж-
нитробензилокси-метилпиридинхлорида - в 18 мл этанола.
2. Смешивают два этих раствора, добавляют 5 г целлюлозы (ватман СС41) и
перемешивают до образования суспензии.
3. Прогревают при 70 °С в чашке Петри до высыхания (-30 мин), затем еще
40 мин при 125°С.
4. Промывают три раза бензолом (по 200 мл) на воронке со стеклянным
фильтром и тщательно отсасывают жидкость. Промывают 1 л воды.
5. Ресуспендируют промытый осадок в 150 мл раствора, содержащего 200 г/л
дитионита натрия, и перемешивают при 55-60 °С в течение 30 мин.
6. Промывают три раза водой (по 200 мл) и два раза 30%-ной уксусной
кислотой (по 200 мл) и снова водой до тех пор, пока не исчезнет запах
II2S.
7. Полученный материал высушивают в эксикаторе при 20 °С. Если он
содержит комки, их растирают в порошок. "Аминоцеллюлозу" хранят в
эксикаторе при 4 СС в течение нескольких месяцев.
Б. Приготовление белка Если используются антитела к иммуноглобулинам из
сывороток или асцитных жидкостей, то применяется осаждаемая
соответствующей концентрацией сульфата аммония фракция (между 40 и 50%).
которую тщательно диализуют против буфера.
В. Приготовление диазоцеллюлозы
1. Растворяют 1,5 г хлорида меди в минимальном количестве воды (5 мл) до
образования раствора зеленого цвета и добавляют в избытке (-75 мл)
свежеприготовленный 1 М NaOH прн постоянном перемешивании.
2. Образовавшийся голубой осадок дважды промывают водой (по 100 мл) на
бюхнеровской воронке через два слоя фильтровальной бумаги ватман 41 до
тех пор, пока pH промывной жидкости не станет меньше 9 и подсушивают на
воронке.
3. Осадок соскребают с фильтра и растворяют в 40 мл свежеприготовленного
0,88 М аммиака (темно-синий цвет) для образования насыщенного раствора.
Интенсивно перемешивают не менее 15 мин.
4. Растворяют в 40 мл этого аммиачного раствора гидроксида меди 0,5 г
порошкообразной "аминоцеллюлозы". Тщательно перемешивают как минимум 15
мин.
5. Центрифугируют прн 5000 g в течение 5 мин для удаления избытка
гидроксида меди и/или комков "аминоцеллюлозы".
6. Переносят осадок в 1500 мл воды, что дает бледно-голубой раствор.
Добавляют 10%-ную H2S04 до тех пор, пока раствор не станет бесцветным или
очень слабо окрашенным, а pH не уменьшится до 4. При этом "амнноцел-
люлоза" флоккулирует с образованием белого преципитата.
7. Дают раствору отстояться в течение 30 мнн, а затем тщательно
отсасывают воду.
8. Преципитат промывают четыре раза холодной водой (порцнямн по 100 мл),
каждый раз центрифугируя суспензию. Если целлюлоза плохо осаждается при
центрифугировании, добавляют одну-две капли 1 М НС1.
9. Охлаждают целлюлозу при 4°С. При этом она может приобрести розоватую
окраску.
10. Ресуспендируют "аминоцеллюлозу" в 50 мл свежеприготовленной
холодной 2М НС1. Добавляют 2 мл 1 % -кого (в/о) нитрита натрия и
проверяют на наличие свободного окислителя, используя йод-крахмальную
бумагу (ватман), которая от окислителей чернеет. Суспензию перемешивают
20 мин
Иммунологические методы исследования мембран
119
Продолжение
при 4°С.
11. В смесь добавляют избыток сухой мочевины до тех пор, пока йод-крах-
мальный тест не даст отрицательную реакцию, а затем промывают при 4°С три
раза водой и два раза 0,2 М боратным буфером1'. Между промывками
суспензию центрифугируют.
12. Осадок ресуспендируют в небольшом объеме (25 мл) 0,2 М боратного
буфера. Для проверки полноты диазотирования добавляют небольшое
количество суспензии к слабому раствору ^-нафтола в воде, после чего
должна появиться ярко-оранжевая окраска.
Г. Связывание белка
1. Сразу же после приготовления диазоцеллюлозы ее добавляют к равному
количеству белка, растворенного в боратном буфере (обычно 100 мг
целлюлозы на 100 мг белка). Общий объем смеси составляет ~15 мл.
2. Инкубируют 48 ч при 4°С в темноте, все время перемешивая.
3. Суспензию центрифугируют и супернатант сохраняют, поскольку его можно
снова использовать для связывания белка.
4. Иммуносорбент промывают три раза в 0,2 М боратном буфере.
5. Ресуспендируют иммуносорбент при концентрации 5 мг/мл в 0,2 М боратном
буфере.
6. Количество белка, связавшегося с иммуносорбентом, измеряют методом
Лоури. Обычно на 1 мг целлюлозы приходится 200-300 мкг связанного белка.
Получение целлюлозных нммуносорбентов схематически представлено на
рис. 3.1.
') 0.2 М боратный буфер имеет следующий состав: 12,4 г борной кислоты,
14.9 г КС1 на 1 л; pH доводят до 8.2 с помощью NaOH.
возможность заранее связать антиген с радиоактивно меченным лигандом, то
