Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
нет нужды получать его в очищенном виде [21], но в этом случае мы не
выявим антитела к сайту связывания лиганда.
Можно разработать методы скрининга антител к ферментам, не требующие
наличия очищенных ферментных препаратов. Антитела, не подавляющие
активность фермента или оказывающие лишь частичное ингибирующее действие,
можно выявить путем инкубации иммобилизованных антител в разбавленном
растворе фермента и последующего добавления после промывания субстратной
смеси. Этот метод особенно удобен, когда проводится колориметрический
анализ с использованием пластин с 96 лунками, поскольку поглощение можно
очень быстро измерить на приборе Titertek Multiscan (фирмы Flow
Laboratories). Лунки с положительной реакцией можно выявить еще быстрее
визуально. Именно таким образом были выявлены моноклональные антитела к
изоферментам щелочной фосфатазы [22, 23].
При тестировании антител желательно не ограничиваться только
исследованием действия культуральной среды на антиген, поскольку
культуральная среда, содержащая сыворотку
120
Глава 3
Таблица 3.3. Методы скрининга моноклональных антител к компонентам
мембран
А. Методы сенсибилизации пластин с 96 лунками I. Растворимые белки
1. В каждую лунку заливают по 100 мкл раствора белка с концентрацией 10-
100 мкг/мл в буфере, pH которого близок к нейтральному, например PBS (pH
7.5) или 50 мМ калий-фоефатнып буфер (pH 6,5), и инкубируют в течение
нескольких часов при комнатьой температуре или в течение ночи при
4 °С. Вместо этого можно выпарить раствор в лунках, поместив открытые
пластины в ламинарный шкаф на ночь.
2. Раствор белка удаляют и промывают лунки два-трн раза буфером (скажем,
PBS), содержащим балластный белок, например БСА в концентрации 1- 10
мг/мл или желатин в концентрации 5 мг/мл, для блокирования всех мест
связывания белка.
II. Мембраны
Мембраны можно использовать для непосредственной сенсибилизации пластин,
как это описано для растворимых белков, или связывать их через полн-Б-
лизин.
1. В каждую лунку вносят 50 мкл раствора поли-Б-лнзнна (Sigma No. Р-1399,
мол. масса 150-300 кДа) с концентрацией 1-2 мг на 100 мл в буфере
(например, PBS, pH 7,5) и инкубируют 1 ч при 37 °С.
2. Раствор полилизина удаляют и пластину однократно промывают буфером.
3. Добавляют в лунки по 25 мкл суспензии мембран с концентрацией 60-• 120
мкг белка/мл и инкубируют в течение 1 ч прн 4°С. Мембраны можно также
осадить центрифугированием при 1000 g в течение 20 м ш при 4СС (например,
используя центрифугу Hereus Christ Minifuge GL).
4. Удаляют жидкость из луиок и промывают их буфером.
5. Наполняют лунки буфером, содержащим 1% БСА, для блокирования свободных
мест связывай 1Я. В таком виде пластину можно хранить прн - 20 °С.
III. Целые клетки
Прикрепляющиеся клетки, например фибробласты, можно выращивать
непосредственно на пластинках для скрининга. Если имеется специальная
центрифуга для осаждения клеток в пластиках, можно использовать и другие
клетки. Для прикрепления клеток применяют также поли-Ь-лизин - примерно
так, как это описано для клеточных мембран. Число клеток на лунку
составляет I05-
106. Применяют также фиксацию глутаровым альдегидом, хотя при этом могут
разрушаться некоторые антигенные сайты11.
1. В каждую лунку вносят по 106 клеток и центрифугируют пластину (100 g,
5 мин).
2. Осторожно погружают пластину в стакан на 1 л, содержащий
свежеприготовленный 0,25%-ный глутаровый альдегид в PBS при 4°С, и
инкубируют 5 мнн.
3. Промывают пластину в PBS, содержащем 1 мг/мл БСА.
IV. Гликолипиды
Пластины можно сенсибилизировать гликолипндами, внося их в лункн в
летучих растворителях, например в метаноле или этаноле. Растворитель
испаряют на воздухе или в потоке азота, а затем пластины промывают
забуференным раствором белка для блокирования свободных мест связывания.
Б. Методы тестирования
I. Меченые антитела н сенсибилизированные антигеном пластины
I. Пластину на 96 лунок сенсибилизируют антигеном, как это описано в
разд. А.
Иммунологические методы исследования мембран
121
Продолжение
2. В лунки вносят 50-100 мкл культуральной среды с добавлением 50 мкл
буфера, содержащего не менее I мг/мл БСА, и инкубируют I ч при комнатной
температуре.
3. Отмывают пластины 2-3 раза буфером.
4. Пластину инкубируют с мечеными антителами к иммуноглобулинам, например
с [1251]-антителами (10 000 имп./мин на лунку) или с антителами,
конъюгированными с ферментом в течение I ч при комнатной температуре.
5. Промывают пластину три раза буфером.
6. Вырезают лункн для определения связанной радиоактивности или добавляют
в них набор реагентов дтя определения ферментативной активности; лунки,
дающие позитивную реакцию, выявляют визуально илн с помощью
спектрофотометра Multiscan.
II. Радиоактивно меченный антиген и пластины, сенсибилизированные
глобулинами
1. Иодируют белок так, чтобы на моль антигена приходилось <1 моля
включенного Г125Ц. Разбавляют до 200 000 имп./мин на 1 мл в
соответствующем буфере, содержащем >1 мг/мл БСА и подходящий детергент,
