Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
или миеломных клеток достаточно присутствия в среде 5- 10% СПК (DMEM 5-
DMEM 10), но в случае свежеприготовленных гибридом концентрация СПК
должна составлять 20%.
2. Среды ГАТ и ГТ можно купить или приготовить из исходных
концентрированных растворов.
ЮОХгипоксантин/тимидин (ГТ): растворяют 136 мг гипоксантпна и 39 мг
тимидина в 100 мл воды или нагреванием до 70 °С, или добавлением NaOH.
ЮОХаминоптерин (А): 1,76 мг на 100 мл воды.
Оба раствора можно стерилизовать фильтрованием или добавлять в среду
перед ее стерилизацией фильтрованием. Среду ГАТ (она содержит 5 мл 100ХГТ
и 5мл100хА на 500мл) перед осуществлением слияния следует проверить на
способность поддерживать рост гибридных клеток и вызывать гибель клеток
миеломы.
3. За сутки до слияния готовят 50%-ньш раствор ПЭГ. Для этого автоклави-
руют 10 г ПЭГ 1500 в течение 20 мин и добавляют 10 мл DMEM (подогретой до
37 °С), пока ПЭГ еще не остыл. В день слияния слегка подщелачивают
раствор при встряхивании на воздухе в стерильной камере до тех пор, пока
цвет по феноловому красному не станет розово-оранжевым.
В. Клетки миеломы
1. Для одного слияния выращивают 2-107 клеток миеломы в среде DMEM 10.
Для слияний с мышиными клетками используют линии P3-NSl-Ag4-l (NS-1) (не
продуцирует эндогенных тяжелых цепей), X63/Ag 8.653 или NS 0/1 (не
продуцируют эндогенных иммуноглобулиновых цепей). Для слияний с крысиными
клетками рекомендуется линия Y3-Ag 1.2.3 (не продуцирует эндогенных
тяжелых цепей).
Иммунологические методы исследования мембран
11&
Продолжение
2. Перед слиянием культуры выдерживают в логарифмической фазе роста по
меньшей мере одну неделю при концентрации клеток (10-30)-104/мл-
Г. Слияние клеток
1. Животных умерщвляют методом цервикальной дислокации илн помещением их
в атмосферу С02, затем или протирают спиртом, или погружают в спирт и
удаляют селезенку в стерильных условиях. Селезенку помещают в чашку
Петри, содержащую 5 мл DMEM 2.
2. Берут максимально возможное количество крови путем пункции сердца.
Полученную из кровн сыворотку сохраняют для тестирования.
3. От селезенки отделяют соединительную ткань, надрезают капсулу и
помещают спленоциты в пробирку с круглым дном; клетки диспергируют в 10
мл DMEM2, используя гомогенизатор со слабо притертым тефлоновым пестиком.
4. Суспензию переносят в центрифужную пробирку на 30 мл, доводят объем
среды до 20 мл и центрифугируют прн 600-700 об/мин в течение 7 мин прн
комнатной температуре.
5. Спленоциты ресуспендируют в 21 мл среды DMEM 2, отбирают 1 мл
получившейся суспензии и разводят в 19 мл DMEM для подсчета клеток.
6. Спленоциты и миеломные клетки осаждают центрифугированием и ресус-
пенднруют 2-108 клеток селезенки (~ 1 селезенка мыши или 1/2 селезенки
крысы) и 2-107 клеток миеломы вместе в 20 мл DMEM и осаждают еще раз.
7. Тщательно удаляют надосадочную жидкость, затем для диспергирования
клеток встряхивают пробирку, постукивая по ней, и помещают в стаканчик с
водой при 37 СС.
8. Добавляют 1 мл 50%-ного ПЭГ (предварительно подогретого до 37°С) в
течение одной минуты с постоянным осторожным перемешиванием клеточного
осадка. Встряхивают пробирку в течение 1 мнн, добавляют за 1 мин 1 мл
DMEM (при 37 °С), после чего в течение следующих 5 мнн при постоянном
встряхивании добавляют еще 19 мл DMEA1 (при 37 °С).
9. Клетки осаждают и осторожно ресуспендируют в 100 мл среды DMEM 20,
после чего разливают в четыре пластины с 96 лунками или в четыре пластины
с 24 лунками.
10. Клетки выращивают в течение ночи прн 37 °С в атмосфере увлажненного
С02.
Д. Отбор гибридом на среде ГАТ
1. На следующий день удаляют половину культуральной жидкости и заменяют
таким же объемом среды ГАТ, содержащей 20% СПК.
2. Эту процедуру повторяют в течение еще двух дней. За это время погибает
большинство клеток.
3. Через неделю должен быть четко виден рост гибридом, и можно
тестировать культуральные среды на присутствие специфических антител.
Аминоптерин является очень эффективным ингибитором ферментов, поэтому
гибридом у не следует переносить сразу же в DMEM-20 после того, как в
селективной среде ГАТ погибли все не слившиеся со спленоцитами миеломные
клетки. Чтобы перевести клетки из среды ГАТ, их вначале выдерживают в
среде ГТ.
Е. Клонирование
Отобранные при скрининге клетки переносят на пластины с 24 лунками,
выращивают до большой плотности н клонируют методом предельных разведений
или в полужидком агаре. Для линий крысиных клеток предпочтительно
клонирование в агаре, а для большинства мышиных линий удовлетворительные
результаты дает метод предельных разведений.
8*
416
Глава 3
Продолжение
I. Метод предельных разведений
Для клонирования этим методом необходимо использовать фидерные клетки,
способствующие поддержанию роста гибридомных клеток при низких
концентрациях.
1. Готовят суспензию спленоцитов неиммунизированных животных (см. разд.
"Слияние клеток") в 20 мл среды DMEM20 на одну селезенку мыши или готовят
суспензию перитонеальных макрофагов, промывая брюшную полость животного
