Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 52

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 191 >> Следующая

10 мл DMEM 20.
2. Подсчитывают число гибридных клеток и разводят суспензию до
концентрации 10-20 клеток на 1 мл в 20 мл DMEM 20, содержащей ГТ, куда
заранее добавлено 2 мл суспензии фидерных клеток; переносят полученную
суспензию на пластину с 96 лунками.
3. Через 1 нед пластины просматривают, визуально выявляют рост отдельных
колоний и отбирают аликвоты культуральной жидкости из соответствующих
лунок для тестирования. Материал из нескольких "позитивных" тунок
выращивают, замораживают исходные культуры, а выращенный материал
повторно клонируют. Моноклональная клеточная линия при реклоннровании
будет давать 100% позитивных колоний.
II. Клонирование в полужидком агаре
1. Готовят 1,1%-ный (в/о) агар Difco при подогреве, затем охлаждают и
поддерживают при температуре 45 °С.
2. Добавляют равный объем DMEM 2 (при 45 °С) и 1/10 объема СПК.
3. Вносят 2 мл такой среды в чашку Петрн диаметром 35 мм и оставляют до
затвердения.
4. Готовят шестикратные разведения содержимого позитивных лунок в 1 мл
DMEM 10, добавляют 1 мл полужидкого агара и переносят в чашки Петри с
застывшим агаром.
5. Выращивают культуру в течение 1 нед в атмосфере увлажненного СО2,
после этого отдельные колонии можно отбирать из агара с помощью
пастеровских пипеток и переносить для культивирования в жидкой среде.
Е. Замораживание клеток
1. Клетки в экспоненциальной фазе роста осаждают и ресуспендируют до
концентрации 2-10е клетка/мл в охлажденной среде DMEM20, содержащей 10%
ДМСО.
2. Переносят аликвоты по 1 мл в пробирки для замораживания, помещают
пробирки в коробку из пенопласта, которую в течение 1 сут выдерживают при
температуре - 70 °С, а затем переносят в жидкий азот.
3. Быстро размораживают содержимое пробирок, погрузив их в водяную баню с
температурой 37 °С, добавляют 10 мл DMEM20, осторожно осаждают клетки,
ресуспендируют их в нескольких миллилитрах DMEM 20 и культивируют.
4. По одной пробирке из каждой замороженной партии следует использовать в
качестве контроля: разморозить ее содержимое и проверить клетки на
жизнеспособность и стерильность.
Ж. Получение асцитной жидкости
1. За две или более недель до введения животным клеток, продуцирующих
антитела, животных подготавливают: вводят им внутрибрюшинно прнстан
(тетраметилпентадекаи) в количестве 0,5 мл на мышь или 1,5 мл на крысу.
2. Гибридомы берут в экспоненциальной фазе роста из расчета примерно 5-
106 клеток на животное.
3 Перед введением клеток в брюшиую полость их промывают в бессывороточ-
ной среде.
Иммунологические методы исследования мембран
117
Продолжение
4. Через 1-2 нед обычно начинается накопление асцитной жидкости.
Выжидают, пока у животных не разовьется сильный отек, а затем умерщвляют
их. От мыши получают 5 мл жидкости, а от крысы - 40 мл. Можно также
отбирать жидкость через день толстой иглой, вводя ее в брюшную полость.
Этим методом получают 15-20 мл асцитной жидкости от каждой мыши.
5. Асцитную жидкость центрифугируют для удаления клеток.
3. Выделение антител из асцитной жидкости
1. К асцитной жидкости добавляют равный объем насыщенного сульфата
аммония, и прецнпитировавший белок осаждают центрифугированием.
2. Осадок растворяют в равном объеме 100 мМ калнй-фосфатного буфера, pH
8, и повторяют преципитацию, растворяя осадок в 10 мМ калий-фосфат-ном
буфере, pH 8.
3. Дпалнзуют полученный раствор против 10 мМ калий-фосфатного буфера и
наносят диализат на ионообменную колонку с DE-52, уравновешенную тем же
буфером. Антитела содержатся в первом главном пике белка; их можно
сконцентрировать фильтрацией на ячейках фирмы Amicon, используя,
например, мембрану РМЗО. Выход антител зависит от используемой клеточной
линии, но он не должен быть ниже 5 мг белка на 1 мл асцитной жидкости.
4. Антитела элюируют калий-фосфатным буфером возрастающей концентрации
(10-200 мМ).
времени и средств лучше тестировать материал, собранный сразу из четырех
или шести лунок, а затем проводить тестирование отдельных лунок из числа
тех, материал которых в совокупности дал позитивную реакцию.
Выбор метода тестирования зависит от природы антигена, его количества и
степени очистки. Многие методы скрининга, используемые в нашей
лаборатории, включают применение иммуносорбента на основе бараньих
антител против иммуноглобулинов класса G мыши, иммобилизованных на
аминоцеллюлозе (табл. 3.2 и 3.3,5; рис. 3.1). Для получения этих антител
проводили иммунизацию барана моноклональными антителами МОРС 21 класса
IgG, секретируемыми гибридомой на основе миеломной линии P3-X63/Ag8.
Обычно удается достичь уровня связывания 0,3 мг IgG на 1 мг целлюлозы, и
0,25 мг такого иммуносорбента имеет достаточную емкость для связывания
всего количества мышиных иммуноглобулинов в 100 мкл культуральной
жидкости или в 100 мкл сыворотки мыши при разведении 10-3. Альтернативный
подход состоит в сорбции антител к Ig мыши (или крысы) на пластинах с 96
лунками (табл. 3.3.,А). Сорбционная способность пластин по крайней мере в
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed