Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 50

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 191 >> Следующая

иммобилизованного на сефарозе белка А [17].
2.3. Получение моноклональных антител
Моноклональные антитела получают иммортализацией индивидуальных В-
лимфоцитов, продуцирующих антитела, путем слияния с миеломными клетками
соответствующих линий. Образующиеся гибридные клетки сохраняют
характерную для миеломы способность к росту и секретируют антитела,
кодируемые геномом лимфоцита. Таким образом удается получить перманентный
источник антител определенной специфичности [18].
Принципы и процедуры получения моноклональных антител
Иммунологические методы исследования мембран
113
изложены в работах [19, 20]. В рамках этой главы мы можем дать только
краткое описание основных экспериментальных подходов, используемых в
нашей лаборатории (табл. 3.1). Мы осуществляем слияние клеток селезенки
иммунизированных животных с клетками миеломы, используя 50%-ный
полиэтилен-гликоль, а затем помещаем клетки в среду, содержащую
гипоксантин, аминоптерин и тимиднн (среда ГАТ). Аминоптерии, являясь
антагонистом фолиевой кислоты, блокирует синтез нуклеотидов de novo, а
для функционирования альтернативного "запасного" метаболического пути
необходимы гипоксантин и тимидин; клетки миеломы, используемые для
слияния, не содержат основного фермента, необходимого на этом пути, -
гипок-сантингуанинфосфорибозилтрансферазы - и погибают в среде ГАТ.
Спленоциты имеют этот фермент, но не растут в культуре. Поэтому в среде
ГАТ могут расти только гибридные клетки. Обычное слияние, при котором
берут 2-107 клеток миеломы и 2-108 спленоцитов, позволяет получить около
103 гибридных клеточных линий. Гибридные клетки примерно в течение недели
выращивают в культуре перед тем, как тестировать культуральную среду на
присутствие антител нужной специфичности. Избранные для дальнейшей работы
клеточные линии после этого дважды клонируют, применяя обычно метод
предельных разведений, и исходные культуры замораживают. Препаративные
количества антител получают культивацией клеток в виде асцитной опухоли в
животных соответствующих линий. Антитела выделяют из асцитной жидкости
осаждением сульфатом аммония и последующей ионообменной хроматографией
[16]. Метод, использующийся для получения моноклональных антител в нашей
лаборатории, подробно описан в табл. 3.1.
2.4. Скрининг моноклональных антител
Обязательным условием успешного получения моноклональных антител является
наличие хорошего метода скрининга. Выбранный метод или комплекс методов
должен обладать чувствительностью, достаточной для выявления
соответствующих антител в концентрациях менее 1 мкг/мл в объеме
культуральной среды 50-100 мкл. В результате одного слияния получают от
100 до 400 лунок для тестирования в зависимости от того, распределяли ли
клетки после слияния по четырем пластинам с 24 лунками в каждой или по
четырем пластинам с 96 лунками. Если применять пластины с 24 лунками, то
мы получим 1-2 мл культуральной среды для тестирования на лунку, но при
этом следует иметь в виду, что отрицательные клоны, которые растут
быстрее, могут перерасти медленно растущие позитивные клоны. При
скрининге на пластинах с 96 лунками для экономии
8-1488
114
Глава 3
Таблица 3.1. Получение моноклональных антител к мембранным белкам
А. Схема иммунизации
Готовят эмульсию антигена в полном адъюванте Фрейнда и вводят внутри-
кожно 1-100 мкг белка на животное при общем объеме вводимой жидкости
0.2.0.5 мл на мышь н до 1 мл на крысу. Миеломы мышей были получены от
линии BALB/c, а миеломы крыс - от линии Lou. Чтобы использовать для
иммунизации животных других линий, необходимо выращивать соответствующих
гибридных животных для получения асцитных жидкостей. Количество вводимого
антигена зависит от степени его очистки, и для чистого препарата
достаточно 10 мкг белка. Если для иммунизации используются целые клетки,
их отмывают от содержащей белки среды и вводят внутрибрюшинно (0,5 -106-
1-107 клеток в 0,5-1,0 мл солевого раствора).
Через 3-4 нед можно провести дополнительную иммунизацию антигеном в
неполном адъюванте Фрейнда, но во многих случаях удовлетворительный
иммунный ответ удается получить после бустерного введения антигена в
солевом растворе через 6-8 нед после первичной иммунизации. При бустерном
введении антигена мышам его можно инъецировать внутрибрюшинно или
внутривенно, а для крыс приемлем только последний вариант. Через трое
суток после бустерной инъекции антигена животных тестируют на присутствие
в сыворотке специфических антител, с тем чтобы отобрать особей, клетки
крови которых будут использованы для слияния; его проводят на следующий
день. Порцнн крови объемом 100-200 мкл можно получить, отрезав острым
скальпелем или бритвой кончик хвоста у животного (под легкой анестезией).
Б. Культуральные среды
1. Клетки миеломы и гибридомы культивируют прн 37 °С в модифицированной
Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей инактивированную нагреванием
сыворотку плода коровы (СПК). Для хорошо стабилизировавшихся гибридомных
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed