Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
антитела только к определенным участкам белковых молекул. Получены
перекрывающиеся пептидные фрагменты, содержащие полные последовательности
лизоцима, миоглобина, гемоглобина и бычьего сывороточного альбумина, и
показано, что ограниченное число фрагментов могут абсорбировать все
антитела из поликлональной сыворотки, полученной к интактным молекулам.
Эпитопы были разбиты на две группы: "секвенциальные", представляющие
собой одиночную первичную последовательность аминокислот (именно такие
эпитопы обнаруживаются для всех пяти
Иммунологические методы исследования мембран
111
антигенных участков миоглобина), и "конформационные" эпитопы,
образованные несколькими отдаленными друг от друга участками
аминокислотной последовательности, сближенными при образовании вторичной
или третичной структуры (примером могут служить три антигенных участка
лизоцима). Оба типа эпитопов, обычно встречающиеся по одному на каждые 5-
10 кДа, располагаются на поверхности белковых глобул, иногда в
выступающих петлях. Эпитопы имеют небольшой размер; как правило, они
включают 6-7 аминокислотных остатков на поверхности белка и не
обязательно являются наиболее гидрофильными участками молекул. Лернер и
др. [4] разработали альтернативный подход к определению эпитопов на
поверхности белков. Возможно, с его помощью удастся получать антитела с
заданной специфичностью, используя для этого химически синтезированные
пептиды. Получены антисыворотки к синтетическим пептидам с
перекрывающимися последовательностями, отвечающим полной аминокислотной
последовательности гемаг-глютинина вируса гриппа (НА1), 18 из 20 таких
сывороток реагировали с интактным природным белком. Анализ структуры
этого гемагглютинина показывает, что определенная часть каждого
иммунореактивного пептида располагается на поверхности интактной
молекулы. В целом антигенные свойства данного участка белковой молекулы,
вероятно, определяются его доступностью, гидрофильностью и мобильностью
[5].
Поликлональные антисыворотки образуются в результате сложной
последовательности событий в иммунной системе, в том числе супрессии
клонов лимфоцитов, продуцирующих антитела к некоторым участкам
иммуногена. Поскольку при получении моноклональных антител происходит
иммортализация соответствующих клонов на определенной стадии развития,
могут образовываться антитела к самым неожиданным участкам антигена,
отсутствующие в поликлональных антисыворотках. Анализ моноклональных
антител, продуцирующихся на различных стадиях формирования иммунного
ответа [6], может наметить подходы к повышению эффективности получения
антител определенной аффинности и специфичности.
2.2. Иммунизация животных для получения поликлональных антител
Какой-либо универсальной методики иммунизации, с помощью которой для всех
антигенов можно было бы получать антисыворотки с высокими титрами, не
существует. Описаны самые разнообразные методы иммунизации, однако
сравнительный их анализ не проводился. Прежде чем приступать к
иммунизации животных препаратами мембран или макромолекул,
112
Глава 3
входящих в их состав, следует обратиться к учебникам по общей
практической иммунологии; это поможет выбрать схему иммунизации [7] и
установить, насколько необходимо использование адъюванта [8]. Возможно,
мембранные белки придется солюбилизировать с помощью детергента, однако
избыток детергента иногда мешает образованию эмульсии с адъювантом.
Вместо солюбилизированных белков для иммунизации можно использовать
кусочки гелей, содержащих белки после электрофореза в ПААГ с ДСН [9];
впрочем, белки из этих гелей можно предварительно извлечь с помощью
электроэлюции (гл. 6). Для иммунизации иногда используют даже полоски
нитроцеллюлозы после блоттинга [10]. Очень трудной задачей оказалось
получение антител к липидным антигенам, причем большинство хороших
сывороток содержат антитела в первую очередь к углеводной части
гликолипидов [11]. Для получения антисывороток использовали разные схемы
иммунизации, в частности иммунизацию целой мембранной фракцией [12],
целыми клетками [13] или очищенными гликолипидами, эмульгированными с
белками [14, 15].
В нашей лаборатории при использовании в качестве иммуногенов мембранных
белков мы обычно иммунизируем кроликов, морских свинок или овец путем
внутрикожного введения во многих точках 10-100 мкг белка на животное при
каждой первичной или вторичной иммунизации. При первом введении антигена
применяется полный адъювант Фрейнда, а при бустерных иммунизациях -
неполный. Интервал между иммунизациями должен быть не менее 6 нед; кровь
у животных берут через 10 сут после второй п последующих иммунизаций.
Собранной крови дают свернуться, сыворотку отделяют центрифугированием, а
затем инкубируют в течение 45 мин при 56 °С, если необходимо
инактивировать комплемент. Иммуноглобулиновую фракцию получают путем
высаливания и хроматографии на колонках, как это описано в различных
руководствах (см., например, работу [16]), или с помощью
