Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Чтобы ускорить серийное разделение и улучшить разрешение метода, были
созданы специальные приборы, позволяющие проводить многочисленные
экстракции и переносы. Они подразделяются на две категории: приборы,
основанные на лротивоточ-ном распределении и работающие по дискретному
принципу переноса Крейга (смешивание-разделение),и приборы для
непрерывной проточной хроматографии. В обоих случаях для ускорения
разделения фаз можно применять низкоскоростное центрифугирование,
особенно когда используются близкие по плотности растворы фиколла и
декстрана. Методом противоточного разделения было проведено
фракционирование гомогената из печени крысы [97].
Успех в применении фазовых систем зависит от адекватности выбора их
состава. Качество разделения зависит не только от конкретного полимера
(пока число их ограничено - в основном используют декстран и ПЭГ), но и
от других параметров: молекулярной массы полимера, концентрации солей,
pH, химической модификации полимера. Например, ПЭГ можно модифицировать
путем этерификации жирными кислотами [98] или при-
3-1488
34
Глава 1
Таблица 1.8. Быстрое выделение плазматических мембран с помощью
распределения в двухфазной системе1"
1. Готовят исходные растворы следующим образом.
20%-иый (в/в) декстран2". Наслаивают 220 г декстрана Т-500 на 780 г воды
и нагревают, слегка помешивая, до растворения. Доводят концентрацию до
20%. добавляя небольшие порции воды и измеряя оптическое вращение на
поляриметре.
30%-ный (в/в) полиэтилеигликоль (ПЭГ) "Carbowax 8000". Берут 300 г ПЭГ на
1 л воды.
Готовят исходные солевые н буферные растворы, в 10 раз более
концентрированные, чем используемые в двухфазной системе.
2. Промывают культивируемые клетки (10е-10s клеток) и гомогенизируют их
любым способом (см. табл. 1.2). Обычно клетки суспендируют в
гипотонической среде (например, в 30 мМ NaHC03, pH 7,0) и гомогенизируют
в плотно притертом гомогенизаторе Даунса; чтобы разрушить более 80%
клеток, может потребоваться до 60 ходов пестика (данные фазово-
контрастной микроскопии). Плазматические мембраны можно стабилизировать,
добавив в среду ZnCl2 до концентрации 1 мМ.
3. Центрифугируют прн 500-1000 g 15 мнн. Ресуспендируют осадок в верхней
фазе, приготовленной, как описано ниже.
4. Смешивают переворачиванием (10-40 раз) 200 г 20%-ного декстрана н 103
г 30%-ного ПЭГ с 33 мл 0,2 М фосфата натрия, pH 6,5, и 179 мл
дистиллированной воды. Оставляют при 4 °С на 24 ч и собирают две фазы.
5. Добавляют осадок или грубую мембранную фракцию к 30 мл верхней фазы,
полученную суспензию поровну делят между тремя поликарбонатными
пробирками объемом 50 мл. Добавляют в каждую пробирку 10 мл нижней фазы,
смешивают и центрифугируют при 2000 g 15 мин в роторе с подвесными
стаканами (Sorvall НВ-4). Если предполагается проводить разделение в
пробирках на 5 мл, объем компонентов может быть пропорционально уменьшен.
6. Собирают мембранный материал с поверхности раздела фаз с помощью
шприца. Любые плазматические мембраны, которые еще остаются в
супернатанте (п. 3), можно осадить при более высоких скоростях,
ресуспенди-ровать осадок и далее использовать методику двухфазного
разделения3".
7. Использование различных тканей и клеток может потребовать модификаций
способа разрушения клеток н подбора скоростей центрифугирования (см.
обсуждение в тексте).
¦) Из работы [90] с изменениями.
!) Мол. масса используемого декстрана [обычно это бывает ро1у(а-1,6-
глюкоза)1 может варьировать в широком диапазоне - от 10 ООО до 2 000 ООО;
чаще всего используют фракцию Т500 (Pharmacia) с мол. массой 450 ООО-500
ООО. Допустимое содержание воды в порошке-10%. Необходимо запастись
достаточным количеством препарата, чтобы его хватило на завершение серии
экспериментов, поскольку его свойства могут меняться от партии к партии.
ПЭГ производства фирмы Union Carbide Corp. обычно поступает в продажу в
виде порошка или хлопьев. ПЭГ 8000 ранее обозначался как ПЭГ 6000.
Физические свойства препарата описаны в буклете фирмы Union Carbide. а)
См. работу [91].
шивания лиганда, которые облегчают разделение, основанное на химическом
сродстве. Именно таким образом удалось выделить частицы из тканей
Torpedo, содержащие никотиновые холинэрги-ческие рецепторы [99], и
получить синаптосомы из мозга теленка, обладающие опиатными рецепторами
[100].
Органеллы и мембраны животной клетки
35
3.3. Проникающая (адсорбционная) хроматография
С помощью шариков из пористого стекла можно разделять небольшие
мембранные везикулы разного диаметра. В качестве примера можно привести
разделение синаптических везикул [101] и везикул щеточной каемки
кишечника [102] на колонке, заполненной стеклянными шариками со средним
диаметром пор 300 нм, предварительно обработанными карбоваксом. Такие
шарики выпускаются фирмой Electronucleonics Inc., Fairfield, NJ, USA.
Мембранные или фосфолипидные везикулы можно разделить ¦по размеру и на
колонках с сефакрилом S-1000 [103]. В работе [104] описано применение
