Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
мембран аппарата Гольджи необходимо измерять в свежевыделенных
субклеточных фракциях. Отмечено, что даже такие ферменты, как глкжозо-6-
фосфатаза и NADPH : цитохрогл с - редук-таза, могут оказаться лабильными
и терять активность в замороженных препаратах мембран из печени [118].
Для правильной оценки распределения фермента-маркера весьма существенным
является пространственное расположение субстратсвязы-вающего сайта в
замкнутых везикулах, а вопрос о латентности ферментативной активности
можно решить, оценив активность в присутствии и в отсутствие 0,1%-ного
дезоксихолата или тритона Х-100. Методы определения ориентации мембран
везикул и наличия утечек описаны в гл. 4.
4.2.2. Химические маркеры
С помощью этих маркеров обычно подкрепляют данные, полученные с
использованием ферментных маркеров, однако работа со многими из них
достаточно трудоемка. Сиаловая кислота и холестерол локализуются
преимущественно в плазматической мембране, но обнаруживаются также в
эндоцитозных мембранах [78, 119]. Кардиолипин находится исключительно во
внутренних мембранах митохондрий, а клатрин, белок с мол. массой 180 кДа,
- в окаймленных мембранах (окаймленных везикулах). Удобным маркером часто
оказывается содержимое
Органеллы и мембраны животной клетки
41
секреторных гранул, когда субклеточные фракции анализируют с помощью
электрофореза в полиакриламидном геле. Таким маркером является, например,
альбумин в секреторных везикулах аппарата Гольджи из печени.
5. Выделение различных органелл и мембранных систем
Подход к выделению субклеточных мембран, описанный выше в общих чертах,
мы теперь конкретизируем применительно к разным органеллам и мембранным
системам. Конечно, существуют схемы фракционирования, где из одного
тканевого гомо-гената получают разные мембраны и органеллы. Так,
гомогенат печени крысы является источником плазматических мембран,
эндоплазматического ретикулума и мембран аппарата Гольджи [120],
энтероциты кролика - источником щеточной каемки, базолатеральных
плазматических мембран, гладкого и шероховатого эндоплазматического
ретикулума и мембран аппарата Гольджи [121]. Однако при таких схемах
выделения, как правило, приходится принимать компромиссные решения
относительно достижимой чистоты фракций. Поэтому в основном для получения
желаемых фракций необходимо выбирать специфические среды, способы
гомогенизации и разделения.
5.1. Ядра и ядерные мембраны
Ядра - это крупные хрупкие органеллы, состоящие из ядер-ной оболочки,
хроматина, ядрышка и различных гранул. Разработаны приемы, помогающие
минимизировать разрушение ядер и последующее высвобождение хроматина,
который во время субклеточного фракционирования прикрепляется к другим
компонентам, особенно к плазматической мембране. Для диспергирования
тканей используют гомогенизаторы с большим зазором (0,12-0,16 мм) и
среды, содержащие 0,32 М сахарозу и 1 мМ MgCl2. Полноценные в
функциональном отношении интактные ядра получают в среде, содержащей
глицерол (50%> в/в); в то же время применение перколла и иодированных
материалов при приготовлении градиентов не нашло широкого
распространения, поскольку эти агенты проникают внутрь выделенных ядер.
Ядерная оболочка состоит из двух мембран толщиной 7,5- 10 нм; наружная
мембрана усеяна рибосомами. При выделении эта структура может
подвергаться интенсивному протеолизу. Однако если экстракцию проводить
при высокой ионной силе [122] (табл. 1.9), то удается получить хорошо
сохранившиеся (если судить по морфологии) ядерные оболочки, лишь слабо
загрязненные гистонами и ДНК. Факторы, влияющие на вое-
42
Глава I
Таблица 1.9. Выделение ядерных оболочек из печени крысы1)
1. Извлекают печень нз нескольких крыс. Отмывают раствором, содержащим
0.25 М сахарозу, 50 мМ трнс-НС1, pH 7,4, 5 мМ MgS04 (буфер 1), измельчают
и гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса (слабо притертом). Фильтруют
через муслиновую ткань и центрифугируют при 800 g 10 мин.
2. Дважды промывают осадок, ресуспендируя и центрифугируя, как описано в
п. 1.
3. Ресуспендируют осадок в буфере, содержащем 2,1 М сахарозу, 50 мМ трис-
НС1, pH 7,4, 5 мМ MgS04 (буфер 2), н наслаивают на подложку из такой же
забуференной сахарозы. Центрифугируют при 70 000 g 60 мин (ротор Beckman
S\V 27 пли аналогичный) и собирают осадок. Еще раз повторяют эту
процедуру, чтобы получить ядра, используя гомогенизатор Даунса для
ресуспендирования осадка.
4. Ресуспендируют ядра и доводят до концентрации 5-108/мл в буфере 1,
куда добавляют ФМСФ до концентрации 1 мМ, и инкубируют с ДНКазой I (250
мкг/мл) и прогретой РНКазон А 60 мин. Центрифугируют прн 800 g 10 мнн и
собирают осадок.
5. Ресуспендируют ядра и доводят до упомянутой выше концентрации в
растворе. содержащем 0.2 мМ MgS04, 10 мМ трис-НС1, pH 7,4, 1 мМ ФМСФ
(буфер 3), и сразу же добавляют 2 М NaCI, растворенный в буфере 3, до
концентрации 1,6 М. Осторожно помешивая, добавляют Р-меркаптоэтанол до
конечной концентрации 1%. Выдерживают 15 мнн и центрифугируют при 1600 g
