Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
ресуспендируют осадок в 10 мМ трнс-НС1, pH 7,4.
5. Такой способ освобождения от содержимого цистерн пригоден также для
микросомной фракции, пероксисом и т. д. Аналогично можно удалить рибосомы
с шероховатого эндоплазматического ретикулума2). В результате описанной
процедуры замкнутые везикулы превращаются в плоские листки, однако
интегральные мембранные белки сохраняются. Добавление в щелочную среду
ФМСФ до концентрации 1 мМ (табл. 1.3) помогает подавить про-теолиз,
который может протекать в этих условиях. Необходимо отметить, что в
процессе щелочной экстракции многие типы ферментативной активности могут
ингибироваться. Альтернативная методика отделения интегральных мембран от
растворимых и периферических белков использует распределение в двухфазной
системе с тритоном Х-114 (Sigma); подробности см. в гл. 6.
*) Из работы [1401.
2) См. работу [142].
Предприняты только первые попытки субфракционировать аппарат Гольджи,
особенно вдоль направления его функциональной полярности, чтобы
охарактеризовать последовательность распределения ферментов. Достаточно
широко используется метод выделения аппарата Гольджи без предварительной
нагрузки тканей животных этанолом [141]. В этом случае можно разделить
"легкую" фракцию, обогащенную секреторными капельками, и "тяжелую",
содержащую элементы типа цистерн. В последнюю входят компоненты,
расположенные с ^пс-стороны аппарата Гольджи. Аналогичным образом с
помощью градиента перколла можно выделить две мембранные фракции [57],
которые содержат сходные количества галактозил- и сиалилтранс-фераз, а
1,2,маннозидаза, маннозидаза II и p-N-ацетилглюкоз-
Органеллы и мембраны животной клетки
47
аминилфосфотрансфераза распределены в них неодинаково Иммунохимические
исследования показали, что галактозил- и сиалилтрансферазы локализованы в
основном на транс-стороне аппарата Гольджи. Для цнс-стороны маркеры пока
не найдены Эти ферменты локализованы на люминальной стороне мембран.
Большие надежды возлагаются на разрабатываемую методику фракционирования
мембран аппарата Гольджи из печени крысы с помощью электрофореза в
свободном потоке (разд. 3.4); перед нанесением образца на гель для
электрофореза его обрабатывают амилазами, а затем подвергают мягкой
механической обработке, чтобы разошлись стопки мембран [111].
Фракции аппарата Гольджи, полученные этими методами из печени,
гетерогенны. Они загрязнены материалом, предназначенным для секреции и
заключенным внутри цистерн и везикул. Для освобождения от растворимых
секреторных продуктов необходимо очистить мембранные фракции,
суспендированные в 0,1 М Na2C03, pH 11,0, центрифугированием согласно
методике, представленной в табл. 1.10 [142, 143]. "Тяжелые" фракции
аппарата Гольджи загрязнены фрагментами плазматических мембран, а
"легкие" - в значительной степени мембранами эндо-сом [56]. Методика,
позволяющая получить обедненные эндо-сомами фракции аппарата Гольджи,
описана в разд. 5.7 (табл. 1.12; рис. 1.8).
5.6. Окаймленные везикулы
Происхождение окаймленных везикул, получаемых из тканевых гомогенатов, до
конца неясно, но, по всей вероятности, их источником являются окаймленные
участки мембраны; здесь можно провести аналогию с образованием микросом
из эндоплазматического ретикулума. Обычно это везикулы диаметром 70-200
нм с характерной покрывающей их "сетчатой корзиной"; эта структура имеет
тенденцию вытесняться с подлежащей мембраны (см. ниже). Размер везикул
варьирует в зависимости от того, происходят ли они из плазматической
мембраны (диаметр превышает 100 нм) или из аппарата Гольджи (диаметр
менее 75 нм) [144]. Окаймленные везикулы обогащены холестеролом [145] и
содержат клатрин - белок с мол. массой 180 000 [146].
Выделение окаймленных везикул облегчается тем, что они имеют высокую
плотность. Для получения фракции окаймленных везикул имеется тщательно
разработанная методика; процедура занимает 36 ч и включает зонально-
скоростное и изо-пикническое - зонально-скоростное центрифугирование в
градиенте плотности сахарозь. [42]. Выделение окаймленных
48
Глава 1
везикул из плаценты человека описано в табл. 1.11. Аналогичным образом
можно выделять окаймленные везикулы из тканей мозга [146]. Каемка при
выделении обнаруживает тенденцию к разрушению и формированию клатриновых
"корзинок", причем этот процесс более выражен при длительном
центрифугировании в 20-60%-ном (в/о) градиенте плотности сахарозы.
Исследовано влияние различных агентов на этот процесс [148]. Если при
выделении использовать центрифугирование в градиенте плотности сахарозы
H2O/D2O - 8%. то можно в значительной мере
Гамогенат печени
'**
юооу, 10мин
Супернатанты 33 OOOgt 8 мин
Супернатант
СохороЗный градиент 15 %
п
Ядра
(промывают Зраза)
Сахарозный
градиент
Рыхлый
осадок
L
осу
205% Флатаиия 29,5%
39,5%
митохондрии,
лизоеомы
Франции
аппарата
Гольдти
G-L
0-1
С-Н
v__
ш ЗЕ *-1
Ж ? 1
57000у. *№ Р
Км 290мин
- Гетнрильтрация -Градиенты найкоденза
