Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
плотности, которые выпускают-
Органеллы и мембраны животной клетки
23
ся фирмой Pharmacia. Кроме того, существует линейная зависимость между
плотностью и коэффициентом преломления (см. Приложение I). Примеры
применения градиентов перколла для выделения субклеточных компонентов
приведены в табл. 1.5. В табл. 1.4 перечислены случаи использования
градиентов перколла для выделения субклеточных компонентов из различных
тканей и клеток.
2. Метризамид (Metrizamide(r)) и найкоденз (Nycodenz(r)'^ Применению этих
иодированных материалов, изготовляемых фирмой Nycomed, Oslo 4, Norway и
распространяемых в других странах (American distributors 'Accurate
Chemical and Scientific Corp'., 300 Shames Drive, Westbury, NY 11590,
USA), для создания градиентов плотности посвящена другая монография этой
серии [74]. Растворы обоих соединений обладают более низкой осмотической
активностью и вязкостью, чем растворы сахарозы с близкой плотностью (см.
Приложение I). Применение этих реагентов получило самое широкое
распространение - начиная от разделения митохондрий, лизосом и пероксисом
[75] и кончая выделением секреторных гранул, сохраняющих транспортную
активность [76]. Найкоденз обладает некоторыми преимуществами по
сравнению с метризамидом. Во-первых, он легче растворяется в растворах
сахарозы и солей, что упрощает формирование градиентов. Во-вторых, он не
содержит глюкозамнна
V 1.2 I lJ
§ 1,4
§
? 1.5
%
$
$ 1,6
1.7
1.8
Зндосомы
О
Растворимые
белки
Аппарат Гольджи ¦
-S' 'Ррагмёнты плазматической _ С 1 мембраны
кризисом/,/КЛ\ Эритроцит/ Митохондрии \ ч_у
Пероксисомы
Рибосомы+Полисомы ООО оо оооо*#**
> Гликоген
d
ГА ДНК й-Ц---------L
101
10*
10
10°
ю7
Козффициент седиментации, единицы Сведборга
г-не. 1.2. Коэффициенты седиментации и плотности различных субклеточных
компонентов. Эти компоненты можно разделить, по-разному комбинируя
процедуры дифференциального центрифугирования и центрифугирования в
градиенте плотности. Поскольку многие субклеточные компоненты
незначительно различаются по массе и плотности, для их выделения
применяют другие методики, например разделение в двухфазных системах
(разд. 3.2), электрофорез (разд. 3.4) или иммуноаффинную хроматографию
(разд. 3.5). Методы модификации плотности компонентов изложены в разд.
3.1.2 (см. также гл. 2).
24
Глава 1
Таблица 1.4. Примеры использования градиентов перколла') для выделения
органелл и мембран
Фракция Источник Плотность, г/мл Ссылка
Хромаффинные l^rv nttirn Т.Т Надпочечники быка 1,067-1,081 [521
ГиаНуЛЫ Эндоцитозные ве- Клетки К562 1,03 [53]
зикулы Альвеолярные макрофаги кро- 1,05 [49, 50]
лика
Гликосомы Trypanosoma brucei 1,087 [54]
Аппарат Гольджи Печень крысы 1,042; 1,057 [55, 56]
1,028; 1,051 [57]
Лизосомы Печень крысы 1,087 [55, 58]
Кортикальный слой почки кры- 1,15 [51]
С.Ы Лимфобласты человека 1,085 [59]
Щитовидная железа свиньи 1,14 [60]
Митохондрии Печень крысы 1,085-1,100 [61, 62]
Скелетные мышцы быка 1,035-1,070 [63]
Пероксисомы Печень крысы 1,075 [64]
Плазматические Тромбоциты человека - [65]
мембраны Печень крысы, синус 1,02-1,04 [66]
Аорта крысы - [67]
Клетки асцитной опухоли - [48]
Кребса
Кортикальный слой почки кро- 1,037 [68]
лика, 6. л.
Кортикальный слой почкн кро- 1,042 [68]
лика, щ. к.
Нейробластома - [69]
Синаптосомы Мозг крысы 1,04-1,05 [70]
') Градиент плотности создавали с помощью перколла в 0,25 М сахарозе. В
работе 152] применяли 0,27 М раствор сахарозы. В работах [481 и [69] pH
среды равнялся 8,8-9,2, а не 7,6. Обозначения: б. л. -
базолатеральные плазматические мембраны;
щ. к. - щеточная каемка; синус. - синусоидальные домены плазматической
мембраны.
и, таким образом, в меньшей степени мешает определению гли-
козилтрансферазной активности и вообще, как правило, меньше влияет на
результаты исследований активности ферментов. Оба реагента имеют высокий
коэффициент экстинкции при 280 нм, поэтому для определения содержания
белка приходится прибегать к опытам по связыванию с ним красителей;
мешают эти вещества и определению нуклеиновых кислот. Найкоденз не
осаждается при низких значениях pH и его можно удалить из препарата
диализом, ультрафильтрацией или гель-фильтрацией. Он более стабилен и
менее дорог, чем метризамид.
Градиенты найкоденза можно создавать in situ центрифугированием в угловом
или вертикальном роторе, однако лучше все-таки использовать градиенты,
сформированные предварительно в 0,25 М растворе сахарозы, pH которого
доведен до 7,0-8,0.
Таблица 1.5. Примеры методик быстрого разделения фракций мембран и орга-
нелл с применением перколла
А. Разделение плазматических мембран и митохондрий из жировых клеток'<
1. Гомогенизируют изолированные жировые клетки (0,5-0,7 г сырого веса)
встряхиванием на вортексе в течение 30 с в 2-3 мл 0,25 М сахарозы, 10 мМ
трис-НС1, 2 мМ ЭГТА, pH 7,4 (среда А).
2. Центрифугируют при 1000 g в течение 30 с и отсасывают инфранатант и
небольшое количество осадка, расположенного под слоем жира.
