Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
более высокую активность в случае мембран, не являющихся фрагментами Т-
трубочек. Это приводит к более интенсивному поглощению Са2+ такими
везикулами, накоплению в них фосфата кальция и соответственно к смещению
в градиенте плотности сахарозы.
Согласно этой методике [83], мышцы кролика измельчают, гомогенизируют в
гомогенизаторе Уоринга в течение 50 с в среде, содержащей 0,2 М сахарозу
и 0,02 М трис-малеат, pH 7,0,
Микросомы
I
5мл
1Смл
15 мл 5мл
35%
E500DQ
16 ч
ИнкуВаииа В среде с фоссрагпом кальций
25%.
35%
40%
\Я%/
"И-1
Чмл
Чмл
Чмл
35%
63%
1500DD дс
<ер
25мш
35%
56%
63%
Т-труТючки F Ж F I Р
Рис. 1.4. Выделение мембран Т-трубочек из скелетных мышц кролика с
помощью модификации плотности [83]. Из скелетных мышц выделяли микросомы,
наслаивали их на градиент плотности сахарозы н полученную фракцию гладких
мембран (ГМ) после инкубации в среде, содержащей фосфат кальция (см.
текст), вновь наслаивали на градиент сахарозы. После фракционирования в
этом градиенте получали Т-трубочки.
-30
Глава 1
центрифугируют при 3000 g 20 мин. Полученный супернатант центрифугируют
при 10 000 g в течение 20 мин. Конечный супернатант фильтруют через
муслиновую ткань и центрифугируют при 100000 g в течение 1 ч, чтобы
получить микросомную фракцию.
Инкубируют микросомную фракцию (0,1 мг белка на 1 мл) в течение 20 мин
при 22 °С в среде, содержащей 5 мМ MgCl2, 0,15 М КС1, 0,3 мМ СаС12 и 2 мМ
АТР, pH 7,4. Наносят фракцию на сахарозный градиент, показанный на рис.
1.4 (ротор Beckman SW40 Ti или аналогичный). Наиболее легкая фракция
обогащена Т-трубочками; везикулы, содержащие фосфат кальция,
концентрируются при более высоких плотностях; особенно много их в осадке.
3. Эндоцитозные и секреторные везикулы. Равновесные плотности
эндоцитозных везикул, мембран аппарата Гольджи и других гладких мембран
довольно близки, поэтому были разработаны специальные методы изменения
плотности эндоцитозных везикул с использованием специфических лигандов.
Один из методов [84] основан на включении пероксидазы хрена в везикулы
исключительно эндоцитозных мембран с последующей инкубацией в среде для
цитохимического выявления пероксидазы, что приводит к избирательному
увеличению равновесной плотности структур, содержащих этот фермент.
Методика сводится к введению в печень галактозилированного бычьего
сывороточного альбумина, сшитого с пероксидазой хрена, который
локализуется в эндоцитозных везикулах (плотность в сахарозном градиенте
1,11-1,13 г/мл). Для этого готовят раствор галактозилированного
сывороточного альбумина, как это описано в работе [85]. Далее перфузируют
печень крысы этим раствором, через 10 мнн отмывают и фракционируют, как
описано в разд. 5.3, чтобы отделить супернатант от осадка "легких
митохондрий". Осадок мембранных везикул из этого супернатанта (100 000 g
в течение 1 ч) ресуспендируют в 0,25 М сахарозе и центрифугируют в 10-
60%-ном (в/о) градиенте сахарозы (ротор Beckman SW-28 или аналогичный) в
течение 3 ч при 100 000 g. Собирают фракции с плотностью 1,11-1,13 г/мл и
инкубируют их 30 мин при 25 °С в 5,5 мМ 3,3'-диаминобензидине, 11 мМ
Н202. Вновь центрифугируют в 23-60%-ном (в/о) (1,1-1,3 г/мл) градиенте
сахарозы; собирают эндоцитозные везикулы, содержащие лиганд, в диапазоне
плотности 1,19-1,23 г/мл. В общем виде методика описана в табл. 1.7.
Тонкость ее состоит в том, что обработанная фракция должна быть тщательно
отмыта от солюбилизированной или адсорбированной пероксидазы хрена, иначе
может произойти агрегация.
Для выделения эндосом из клеток А431 применяется другой -подход,
основанный на высокой плотности коллоидного золота:
Органеллы и мембраны животной клетки
31
Таблица 1.7. Изменение плотности эндосом для их выделения с помощью ДАБ>>
1. Для эндоцитозиого поглощения, опосредованного рецептором, пришивают
соответствующий лиганд к пероксидазе хрена (ПХ, RZ-3) и отделяют этот
комплекс от свободных лиганда н ПХ.
2. Подбирают условия эндоцитоза так, чтобы сконцентрировать комплекс
лиганд-ПХ в интересующем нас эндоцитозном компартменте [варьируют тип
лиганда, конкуренты, время поглощения (обычно 3-10 мин) и т. д.].
3. Как только станет возможно, освобождаются от содержащейся в среде и
адсорбированной на мембране ПХ, отмывая клетки или перфузируя ткань
холодной солевой средой, содержащей 1 мМ ЭГТА.
4. Выделяют субклеточную фракцию, наиболее обогащенную лигаидом, с
помощью дифференциального центрифугирования (Получение легкой
митохондриальной фракции печени описано в разд. 5.3.) Осторожно
ресуспендируют материал, чтобы избежать освобождения ПХ из поврежденных
орга-нелл.
5. Очищают содержащие лиганды органеллы первым уравновешиванием в
градиенте плотности сахарозы (10-60%, в/°), забуфереином 3 мМ имндазо-
лом/HCl и содержащем метризамид, перколл и т. д. При этом удаляется также
свободная ПХ. которая остается в месте нанесения препарата.
6. Инкубируют 15-30 мин при 25 °С в темноте в свежеприготовленном
