Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Пригодны для гомогенизации тканей, которые сначала необходимо измельчить
или нарезать мелкими кусочками с помощью ножниц. Выпускаются аппараты для
непрерывной гомогенизации (Yamamoto Scientific Co., Minato-ku, Tokyo 105,
Japan, and Northbrook, IL 60062. USA).
Широко применяются. Выпускаются модели с разным размером вала. Возможны
затруднения при стандартизации. Измельчение осуществляется вращающимися
ножницами; пригодны для гомогенизации волокнистых и мышечных тканей. Для
измельчения больших количеств препаратов можно использовать гомогенизатор
Уоринга или гомогенизатор, применяющийся дтя измельчения пиши. Для
объемов пенее 0,5 мл выпускается аппарат "Tissue-Tearor" фирмой Biospec.
Inc., P.O. Box 722, Bartesville, OK 74005, USA.
Позволяют диспергировать клетки за один прием. Отсутствуют тепловые
повреждения. Необходима калибровка для минимизации повреждения орга-нелл.
Величина прикладываемого давления находится в диапазоне от 20 до 100
атмосфер, а время выдерживания под давлением - от 10 до 30 мин.
Поставляются фирмами Parr, Kontes, Braun и Yeda. Применяются также
аппараты с мини-камерами (емкость 5-15 мл).
Широкого распространения не получили. Электрические или гидравлические, с
регулируемым с помощью пружины наконечником. Можно получать хорошие
препараты плазматических мембран. Обычно используется продукция Stansted
и Locke. Помимо пресса Френча применяют множество модификаций, в которых
ткани пропускают под давлением через отверстие или трубочку. Аппараты
Biox X-press (АВ Biox, Box 143, Jarfalla, Sweden S 17523, Life Science
Labs LTD. Sarum Road, Luton, Beds., UK) используют для гомогенизации
замороженных тканей. Пресс для измельчения тканей поставляет фирма Edco
Scientific Inc, РО Box 64с, Sherborn, МА 01770, USA.
Органеллы и мембраны животной клетки
17
2.2. Методики, включающие разрушение клеток 2Л.1. Разрушение тканей и
клеток
Для разрушения тканей разработаны многочисленные методы (табл. 1.2).
1. Изолированные клетки, особенно клетки в культуре, обычно поддаются
разрушению труднее, чем клетки in situ; из них сложнее получить
субклеточные фракции приемлемого качества и с хорошим выходом. Чаще всего
для разрушения используют гомогенизатор Даунса малого объема (5-12 мл) с
плотно притертым пестиком. Таким способом разрушают клетки, подвергнутые
вначале гипотоническому шоку (для этого их инкубируют примерно 10 мин при
4°С в 5 мМ трис-НС1, pH 7,6). Долю разрушенных клеток после гомогенизации
определяют с помощью
А дсорбаи я клеток - нейтрал* зси -
езанвтых sjun-.св
' Грпчулы
Ртпонияе^нйя среда, содержащая ацетат,
p-ffP_______________
- мети Грануле', покрытые клешами
¦Рб
w
Изотоническая среда, содержащая лс/jul чио-ны, лн 7,7
Гранулы, паеоыт/ьр клетками, яас.ю кеипи
<?> - ' ¦О ;
4$
Дважды лрень ватт изотонической средой,рН€~7
Разрушение клеток-выделение плазматических мембран
Дважды промывают изотонической средой,
^ рН6-У^\
№ Органеллы и обломки
О Оо
W
Трижды промывают
гипотонической средой, рНВ~7
Встряхивают Юс
Б гипСтонсчссксм
ультразвуком Гранулы,
1М вусрере Sc покрытые мембранами
Рнс. 1.1. Выделение плазматических мембран с помощью гранул, покрытых
поликатионами [24] (подробности см. в табл. 1.1).
фазово-контрастной микроскопии; она должна быть не менее 80%- Клетки,
растущие в объемных культурах, разрушаются легче, чем клетки в монослоях,
по причинам геометрического характера.
2. Для разрушения клеток в культуре более приемлемы методики,
основанные на кавитации газов. Для этого клеточную суспензию заливают в
заполненный азотом металлический цилиндр и выдерживают 5-30 мин под
высоким давлением (7- 65 атмосфер). При быстром понижении давления до
уровня атмосферного происходит выделение растворенного в цитоплазме
азота, и в результате кавитации при одновременном быстром выведении
суспензии через узкий канал клетки разрушаются. В оптимальных условиях,
которые надо тщательно подбирать для каждого типа клеток, плазматическая
мембрана и эндоплазма-
2-1488
38
Глава 1
тический ретикулум образуют маленькие везикулы, а органеллы остаются
интактными [30].
3. Еще один метод, не поддающийся стандартизации,- обработка
ультразвуком. Этим методом разрушали тучные клетки, причем были подобраны
параметры для получения оптимальных результатов (непрерывная или
импульсная обработка) [31]. Однако необходимо отметить, что одни
популяции тучных клеток разрушаются быстро, тогда как для разрушения
других необходима длительная обработка; важна также концентрация Са2+ в
среде. Эти положения, по-видимому, справедливы для большинства типов
клеток.
4. Многие органеллы и мембранные фракции после выделения подвергают
дальнейшему разрушению для получения субфракций, разделяемых
центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Так, при гомогенизации
плазматических мембран клеток печени гомогенизатором Даунса с плотно
пригнанным пестиком можно получить везикулы желчных канальцев и
компоненты, содержащие области мембранных контактов. Эти фракции можно
