Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
профильтрованном через миллипоровый фильтр растворе, содержащем 5,5 мМ
З.З'-диаминобензиднн (Sigma, Grade II) и 11 мМ Н202; вся система должна
находиться в среде с плотностью, соответствующей плотности раствора для
первого уравновешивания органелл. Измеряют необходимые ферментативные
активности до и после инкубации.
7. Снова уравновешивают образец в градиенте плотности, начиная с
плотности, в которой органеллы были уравновешены первый раз (п. 5).
8. Чтобы учесть влияние загрязнений из центрифужной пробирки, инкубируют
контрольную пробу в отсутствие Н202.
9. Для установления степени агрегации органелл смесь фракции, обогащенной
комплексом лиганд-ПХ. и фракции, полученной из клеток, не обработанных
этим комплексом, а меченных другим изотопом, инкубируют в ДАБ н Н202.
Метка не должна вытесняться.
*) P. Courtoy, личное сообщение. См. также работу [84].
меченные золотом антитела связываются с рецептором транс-феррина [86].
Разделение эндоцитозных и окаймленных везикул, содержащих ферменты, можно
осуществить в градиенте плотности с помощью реагентов Карновски-Рутса.
Эти реагенты избирательно связываются с ацетилхолинэстеразой, в
результате чего образуются отложения железа/меди. С помощью этого метода
удалось в дальнейшем разделить эндо- и экзоцитозные окаймленные везикулы
из перфузированной печени крысы [87, 223].
3.1.3. Компьютерное моделирование субклеточного фракционирования с
помощью центрифугирования
Прежде чем приступать к субклеточному фракционированию путем
центрифугирования, необходимо выбрать тип ротора (угловой, с подвесными
стаканами, вертикальный), время центрифу-
32
Глава 1
гирования, объем образца, тип и объем градиента, диапазон плотности и ее
профиль и т. д. В настоящее время фирмы, изготавливающие центрифуги,
создают программы, которые позволяют промоделировать любое разделение с
помощью .центрифугирования и таким образом уменьшить число пробных и
ошибочных опытов по центрифугированию, а возможно, и вообще избежать их
[88]. Программа "Centrisim" (пакет программ фирмы
Е. I. du Pont de Nemours, CT, USA; Sorvall Equipment) предназначена
для компьютеров Apple или IBM, и ее применение может помочь в более
полной реализации возможностей центрифуг
(c)
Л ^ Г) лабщ Л x'S
P=1,12
P~%20
Рис. I.5. Изменение плотности эндо-сомных везикул из печени крысы с
помощью диаминобеизидина (ДАБ) [84]. ДАБ диффундирует внутрь этих
везикул, содержащих пероксидазу хрена, сшитую с галактозой/БСА. В
присутствии Н2Ог комплекс перок-сндаза-лиганд-ДАБ полимеризует-ся и
остается внутри везикул. Поскольку равновесная плотность полн-
меризованного ДАБ велика, значительно увеличивается и плавучая плотность
эндосомных везикул; это позволяет отделить их от везикул другого
происхождения, не содержащих лиганда, например от фрагментов аппарата
Гольджи.
для оптимизации изощренных препаративных и аналитических методик
разделения. Аналогичная программа разработана также фирмой Beckman.
Применение программ для микрокомпьютеров при субклеточном
фракционировании с помощью центрифугирования детально обсуждается в
другой книге этой серии.
3.2. Разделение в двухфазной системе, содержащей два полимера
Полезным н быстрым способом выделения мембран является разделение их в
водной двухфазной системе декстран-ттолиэти-ленгликоль (ПЭГ), особенно
если отсутствуют необходимые ульт-рацентрифуги и роторы [89]. Метод,
продуктивность которого
Органеллы и мембраны животной клетки
33
может быть легко повышена, основан на использовании целого ряда свойств
мембран, включая электрический заряд, плотность, массу и гидрофобность.
Различие в этих свойствах обусловливает разное распределение компонентов
смеси между верхней, нижней фазами и поверхностью раздела. По сродству к
верхней фазе компоненты животной клетки располагаются в следующем
порядке: эндоплазматический ретикулум*<митохондрии<;лизо-сомы-<аппарат
Гольджи<;плазматическая мембрана.
Этот метод описан в табл. 1.8 и проиллюстрирован на рис. 2.3. Оптимальное
соотношение между степенью очистки препарата и выходом мембран
определяется многими факторами. Чистота фракции плазматических мембран,
локализующихся в интерфазе, сильно зависит от концентрации солей,
осмотичности и pH среды, а также от температуры. Кроме того, поскольку
свойства декстрана из разных партий могут различаться, необходимо
стандартизовать исходные растворы по оптическому вращению с помощью
поляриметра.
Описано применение этого метода для разделения компонентов аппарата
Гольджи из почек [92] и печени [93], а также плазматических мембран из
желчных канальцев и кровеносных лакун печени [94]. С его помощью можно
разделять митохондрии и синаптосомы из мозга взрослой крысы: митохондрии
локализуются в обогащенной декстраном нижней фазе, а синаптосомы - в
верхней [95]. Включение в обе фазы детергентов, например N-
лаурилсаркозината, позволяет быстро очищать постсинапти-ческие уплотнения
(бляшки) из синаптосом коры головного мозга животных [96].
