Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
маркеров увеличивается в 60-80 раз по отношению к гомогенату. Лизосомные
ферменты обнаруживают структурнозависимую латентность, а ферментативная
активность полностью проявляется только после разрушения мембран (обычно
при суспендировании их в 0,1%-ном растворе тритона Х-100).
Лизоеомы были выделены также из аорты кроликов с атероматозом и из
культивируемых клеток [109]. От животных, которым вводился леупептин,
хлороквин или винбластин, получены аутофагические вакуоли - большие
вакуоли, захватившие митохондрии, секреторные гранулы и т. д. Методики их
выделения близки к методикам, применяемым для получения лизосом; в
частности, здесь тоже проводится фракционирование "легкой
митохондриальной" фракции в градиентах метризамида [131] или перколла
[132]. Полученные фракции обладают характерной морфологией и обогащены
лизосомными ферментами-маркерами, но в меньшей степени, чем очищенные
фракции лизосом.
5.4. Пероксисомы
Пероксисомы были определены как органеллы, содержащие каталазу и один или
более ферментов, продуцирующих Н202 [133]. К настоящему времени
исследованы в основном перокси-
Органеллы и мембраны животной клетки
45
сомы из печени грызунов, где их количество можно увеличить до девяти раз,
вводя в рацион животных гиполипидемические средства, такие, как
клофибрат. Есть сообщения о способах выделения пероксисом из почек и
тонкого кишечника [134], из легких [135] и сердца [136].
Стратегия выделения пероксисом из печени включает субфракционирование
"легкой митохондриальной" фракции (см. метод получения в разд. 5.3) в
градиентах метризамида или найкоденза; в этих методиках используются
изоосмотические условия и пониженное гидростатическое давление, что очень
важно при выделении хрупких органелл. Пероксисомы достаточно хорошо
отделяются от лизосом и митохондрий, когда "легкую митохондриальную"
фракцию центрифугируют в 20-50%-ном (в/о) градиенте метризамида;
пероксисомы осаждаются в полосе с плотностью 1,220-1,245 г/мл, а лизоеомы
- при плотности 1,120 г/мл. Фракции загрязнены в основном везикулами
эндоплазматического ретикулума (маркер глюкозо-6-фосфатаза). Удельная
активность после очистки по сравнению с активностью тканевого гомогената
увеличивается в 36-40 раз для ка-талазы, оксидазы а-гидроксикислот и
ферментов р-окисления [137]. Исследован полипептидный и фосфолипидный
состав пероксисом печени крысы [138]. При выделении пероксисом
использовали также градиенты перколла [64], однако уровень загрязнения
митохондриями был при этом выше. Стабильность пероксисом в процессе
выделения повышается при обработке постъядерных супернатантов 1 мМ
глутаральдегидом в 0,5 мМ какодилате, pH 7,4, предварительно
профильтрованном через древесный уголь [139].
5.5. Аппарат Гольджи
Аппарат Гольджи, вначале идентифицированный как морфологически целостное
образование, состоящее из стопок цистерн, выделяют в основном из клеток
печени, хотя известно, что он присутствует во всех неделящихся клетках
секреторных тканей. Эта структура участвует в терминальном
гликозилировании, включении сульфатных групп в белки и липиды,
процессинге гликопротеинов, образовании рецепторов маннозо-6-фосфатных
групп. Этим определяется морфологическая сложность аппарата Гольджи, что
в свою очередь стимулирует попытки его субфракционирования.
Существуют разные методы быстрого получения мембран аппарата Гольджи из
печени крысы [140, 141], при которых мембраны из постъядерного
супернатанта очищают в градиенте сахарозы или перколла [55], где они
концентрируются при низкой плотности (табл. 1.10).
46
Глава 1
Таблица 1.10. Быстрое получение мембран аппарата Гольджи из печени
крысы1) и разделение мембран и растворимого содержимого цистерн
1. Гомогенизируют каждую печень крысы в 26 мл раствора, содержащего 0,5 М
сахарозу, 1%-ный декстран (Sigma, средняя мол. масса 252 000), 38 мМ
трис-малеат, pH 5,4, в течение 60 с при 8000 об/мин в гомогенизаторе
Polytron (см. табл. 1.2; можно использовать также гомогенизаторы Поттера-
Элвехейма/Даунса).
2. Центрифугируют гомогенат при 6000 g 15 мин (ротор Sorvall SS-34 или
аналогичный), собирают верхнюю желтовато-коричневую часть осадка и
ресуспендируют ее в 5-6 мл супернатанта.
3. Наслаивают порции по 1 мл на 7,5 мл 1,2 М сахарозы (приготовленной иа
38 мМ трис-малеате, pH 6,4) в узкие пробирки для бакет-ротора (Beckman SW
28) объемом 13 мл; сверху наслаивают дистиллированную воду.
Центрифугируют при 97 000g 30 мин и собирают грубую фракцию аппарата
Гольджи на границе раздела 1,2 М сахароза/иаиесенная фракция. Собирают
мембраны с помощью шприца и осаждают центрифугированием при 6000 g 20
мин.
4. Чтобы отделить мембраны аппарата Гольджи от содержимого цистерн,
ресуспендируют фракцию примерно в 5 мл 100 мМ ИагСОд, pH 11,0, и
оставляют при 4°С на 30 мин. Концентрация белка должна быть 0,02-1 мг/мл.
Для экстракции пригоден маленький плотно притертый гомогенизатор Даунса.
Центрифугируют при 100 000 g 1ч (ротор Beckman 50 Ti или аналогичный) и
