Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
далее разделить по плотности центрифугированием в градиенте сахарозы [32,
33]. При пропускании через пресс Френча при высоком давлении (~600 атм)
из михросомной фракции скелетных мышц высвобождаются Т-трубочки; они
обладают низкой скоростью седиментации и невысокой плотностью, и их
очищают в градиенте плотности сахарозы [34].
2.2.2. Среды
Состав среды, в которой разрушают клетки, обычно определяется применяемым
методом гомогенизации. Для разрушения тканей используют изоосмотический
раствор сахарозы из расчета 100 мл на 10 г сырого веса ткани; при этом
нестрашно, если раствора сахарозы будет немного больше, особенно при
центрифугировании в роторе с большим объемом. Гипотоническая среда
способствует разрушению клеток, но, если обработка длится слишком долго,
при этом может происходить осмотическое разрушение ортанелл. В
присутствии 1-5 мМ MgCb повреждение ядер минимально, но среды с высокими
концентрациями солен применять не следует, поскольку они вызывают
агрегацию мембран. С другой стороны, везикулы мембран щеточной каемки
можно получить из постъядерной фракции гомогената кишечника или почек
крысы, используя 10 мМ MgCl2, 5 мМ ЭГТА; при этом происходит
избирательное освобождение от других мембран [35, 38].
Поскольку соли Са2+ способны активировать протеазы (см. ниже), их
применения следует избегать. В некоторых случаях происходит стабилизация
мембран в средах с pH 8,0-9,6, на-
Органеллы и мембраны животной клетки
19
пример, при этом снижается интенсивность образования везикул из
плазматической мембраны [36]. В то же время стабильность покрытых
клатрином везикул повышается при pH 6,5-6,8. Все это показывает, как
сложно делать какие-либо обобщения относительно среды для гомогенизации:
каждый мембранный препарат требует индивидуального подхода.
2.2.3. Протеолиз мембран
Проблемы, возникающие при субклеточном фракционировании из-за присутствия
в среде протеолитических ферментов, ранее недооценивали. Это стало ясно,
когда очищенные мембранные препараты стали использовать как исходный
материал для выделения мембранных белков, например рецептора фактора
роста эпидермиса [39] и комплекса щелевого контакта [40]. После
разрушения клетки высвобождаются многие лизосомные ферменты, ранее
изолированные в компартментах, находившиеся в цитозоле или связанные с
мембранами. Мембраносвязанные протеазы активируются при длительных
препаративных процедурах, особенно в присутствии детергентов. Природа
многих из этих протеолитических ферментов нам неизвестна, что усложняет
выбор специфических ингибиторов.
В табл. 1.3 приведены примеры протеаз различных классов, указаны свойства
соответствующих ингибиторов и даны советы по их применению. Наиболее
широко распространенным ингибитором протеаз является, по-видимому,
фенилметилсульфонилфто-рид (ФМСФ). Время его полуразрушения в водной
среде при pH 7 составляет 100 мин, гидролиз происходит быстрее в более
щелочных средах и в средах, содержащих фосфат. ФМСФ, хранящийся в
этаноле, вводят в среду непосредственно перед употреблением, а потом по
мере необходимости добавляют через определенные интервалы времени.
3. Разделение субклеточных компонентов
3.1. Центрифугирование
Методы разделения субклеточных компонентов на основании различий по
скорости седиментации (которая определяется весом, размером и формой
частиц) и плотности достаточно подробно описаны в литературе [9, 41], а
также обсуждаются в гл. 2. Вещество, использующееся для приготовления
градиента, должно быть легко растворимо в воде, физиологически безвредно
и химически инертно; его раствор должен быть невязким, прозрачным в
видимой и УФ-областях спектра, а также должен создавать низкое
осмотическое давление. Обычно разделение суб-
2*
20
Глава 1
Таблица 1.3. Ингибиторы протеаз1-'
Ингибитор Ферменты Обычный диапазон концентраций Комментарии
Амаетатин (также эпиамастатнн) Экзоамннопептидазы 1 -10 мкг/мл
Антнпаин Катепсин В, папаин, трипсин 1 -10 мкг/мл
Бензамнднн Сериновые протеазы До 10 мМ
Бензнлмалеиновая кислота Карбоксипептидазы 1-10 мкг/мл
Бестатнн (также эпибестатин) Экзоаминопептидазы До 1 мкг/мл
Химостатин Катепсин В. химо-трипсин, папаин 1-10 мкг/мл
Диизопропилфтор-фосфат (ДФФ) Сериновые протеазы До 0,1 мМ Очень
токсичен
Дипротнн А н В Дипептндиламнно- пептидазы 10-50 мкг/мл
Элаетатинал Эластаза 10 мкг/мл
Этилендиаминтет-рауксусная кислота (ЭДТА) Металлопротеазы 0,1-5 мМ
Полезный ингибитор широкого спектра действия
Леупептин Катепсин В, папаин, плазмин, трипсин 1-100 мкг/мл
Пепстатин А Карбоксипротеазы (пепсин, ренин) 1-10 мкг/мл Растворим в
этаноле или метаноле лучше, чем в воде
Фенилметилсуль- фонилфторнд (ФМСФ) Сериновые протеазы До 0,1 мМ
Быстро разрушается в водных буферах. Полезный ингибитор широкого
спектра действия
Фосфорамидон Коллагеназа, термолизин 1-10 мкг/мл Ингибитор Zn-npo-
теаз избирательного действия
Органеллы н мембраны животной клетки
21
Продолжение
Ингибитор Ферменты Обычный диапазон концентраций Комментарии
