Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Тетратионат натрия Тиоловые протеазы До 5 мМ
Тозилметилкетон Папаин, трипсин
Тозплфенилала- нпнхлорметнлке- тон Химотрнпснн
Ингибиторы протеаз. типы I-IV Химотрипсин, трипсин Из
различных источников (белок куриного яйца, соя) и с разной активностью
') Поггимо перечисленных следует упомянуть и другие ингибиторы, в
частности па-рахлормеркурибеизоат (ПХМБ), йодацетамид и ионы тяжелых
металлов (для ингибирования -SH-групп), а2-макроглобулин (для
ингибирования коллагенаэ), апротииин (из легочной ткани) и различные
хелатирующие агенты (2-фенаитролин, а а'-бипиридилфто-рид натрия). Многие
из этих ингибиторов поставляются фирмами Sigma и Boehringer. Апротонин
поставляется под торговой маркой Trasylol фирмой Bayer, FRG, и ее
филиалами в других странах. Нуперкаин или тетракаин (0,15 мМ)
предотвращают гидролиз жиров.
Протеолитические ферменты классифицируют по группам, описанным в работе
[37]. Так, в группу сериновых протеаз входят трипсин, химотрипсин,
эластаза, катепсин G и активаторы плазмнногена. функционирующие при pH 7-
9 и подавляемые ДФФ. К тио-ловым протеазам относятся различные
катепсин!ы, активные при pH 3-8 и подавляемые ПХМБ и йодацетамндом.
Карбоксипротеазы включают катепсин D и пепсин, активные при pH 2-7 и
подавляемые пепстатином. В группу металлопротеаз входят протеазы
микроворсинок и коллагеназы, активные при pH 7-9 и подавляемые ЭДТА и
дитио-треиголом.
Обычно используемый "коктейль* протеиназных ингибиторов состоит из
следующих компонентов. А: пепстатии. 0,5 мг: леупептии, 5,0 мг;
химостатнн, 5.0 мг; антипаии, 5,0 мг; апротиннн, 5,0 мг на Ю мл воды. Эта
суспензия используется в разведении 1 : 100. Все перечисленные реагенты
поставляются фирмой Sigma. Б: ФМСФ. 4,3 мг растворяют в 1 мл этанола и
используют в концентрации 200 мкл/100 мл. В: 1 мМ ЭДТА, ДФФ и ПХМБ.
клеточных компонентов проводят в градиенте плотности сахаро-зы. Раствор
сахарозы удовлетворяет большинству указанных требований, но при высоких
концентрациях он весьма вязок. Это, а также имеющие место осмотические
эффекты создают некоторые неудобства (см. Приложение I). Так, в
гиперосмотических растворах сахарозы субклеточные везикулы
обезвоживаются, а секреторные гранулы подвергаются деструктивному лизису,
что ограничивает их пригодность для исследования функций. В растворах с
высокой концентрацией сахарозы происходит "раздевание" покрытых клатрином
везикул. Этот процесс можно частично предотвратить, используя 8%-ный
сахарозный градиент, приготовленный на 'НгО^НгО [42]. Для разделения
замкнутых
22
Глава 1
мембранных везикул и везикул с утечкой [43] с успехом применялись
градиенты декстран-HzO.
Как правило, разделение мембранных фракций в градиенте плотности
осуществляется за 3-4 ч или в течение ночи при 80 ООО g или выше в роторе
с подвесными стаканами (Beckman SW 28 или подобный ему). В некоторых
случаях лучше применять вертикальный ротор; это позволяет уменьшить
гидростатическое давление и время центрифугирования благодаря уменьшению
длины пути. Примером может служить выделение перо-ксисом [44]. Однако при
этом на стенках центрифужных пробирок образуется слоистый осадок, что
создает некоторые неудобства.
Разделение с помощью центрифугирования субклеточных компонентов с
близкими коэффициентами седиментации и плотностью [в их число входят
эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи и мембраны эндосом (рис.
1.2)] затруднено; в этом случае приходится привлекать методы (многомерное
фракционирование клеток), основанные на других свойствах мембран
(например, противоточное разделение) [45, 46].
3.1.1. Новые мвтеривлы для приготовления грвдиентов плотности
1. Перколл. Золь силиконовых частиц, покрытых поливинил-пирролидоном
(Percoll), позволяет уменьшить скорость центрифугирования и создать
изоосмотические условия при выделении клеток и субклеточных частиц. Эти
преимущества особенно ценны при получении хрупких органелл и везикул для
исследований транспорта. Как правило, для выделения используется перколл,
суспендированный в изоосмотическом растворе сахарозы при нейтральном pH,
но в отдельных случаях разделение субклеточных компонентов улучшается при
pH 9,0 [36]. Есть множество примеров, когда результаты разделения в
перколле были ненамного лучше, чем в градиенте сахарозы.
Присутствие перколла затрудняет определение белка по методу Лоури, но
можно применять модифицированный метод с использованием кумасси синего
(метод Брэдфорд) (гл. 6). При определении большинства типов
ферментативной активности влияние перколла минимально. Коллоидные
силиконовые частицы обычно можно удалить дифференциальным
центрифугированием или гель-фильтрацией через матрицу с сорбентом
Sephadril
S-1000 Superfine, как при очистке секреторных гранул из хром-аффинной
ткани быка [47].
Плотность, при которой происходит уравновешивание интересующей нас
фракции в перколле, можно определить путем одновременного
центрифугирования аналогичных градиентов, содержащих окрашенные маркеры
