Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
этого метода для определения размеров везикул и разделения окаймленных
везикул с использованием жидкостной хроматографии высокого разрешения
[104].
3.4. Электрофорез
С помощью высоковольтного электрофореза в свободном потоке можно получить
препараты субклеточных мембран и органелл высокой степени чистоты [105].
Особенностью последних моделей приборов для электрофореза, например
Elphor-VaP. 22, поставляемых фирмой Bender and Hobein (Lindwurmstr. 71,
D-8000 Munich 22, FRG) (American distributors Protein Technologies Inc.,
1700E, 18th St., Tucson, AZ 85719, USA), является то. что они
предназначены для фракционирования субклеточных компонентов, полученных
центрифугированием. Подлежащую разделению смесь компонентов подают тонкой
струйкой в разделяющий буфер, который движется в электрическом поле;
мембраны, несущие разный электрический заряд, перемещаются в разделяющей
ячейке со скоростью, определяемой их зарядом, при этом достигается 100%-
ное разрешение (рис. 2.4). Это мягкий способ выделения мембран с высоким
препаративным выходом.
Методику электрофореза в свободном потоке впервые применили для выделения
лизосом из печени крысы и затем использовали для получения субфракций
плазматических мембран из лимфоцитов [106] и лейкоцитов [107], лизосом и
митохондрий из печени крысы [108], лизосом из клеток в культуре [109], а
также для разделения правильно ориентированных и вывернутых
эритроцитарных везикул [110]. В настоящее время этот метод пытаются
приспособить для разделения компонентов аппарата Гольджи [111] и
эндоцитозного компартмента [78] из печени крысы - объектов, для которых
применение других методов затруднено.
Рис. 1.6 иллюстрирует применение этой методики для разделения
поверхностных и внутренних мембран тромбоцитов. Тром-
3*
Берок, мг/мл со Белок, мг/мл &! Белок, мг/мл
36
Глава 1
Обработка нейраминивазой
Поверхностные мембраны
(c)
10000
EOOD |
7000
Номер фракции
Обработка нейраминивазой ЭДТА 8 гаадиенте отсутствует
0,25-
0,20-
0,15
0,10 -
0,05 -
30 35
Номер фракции
|
| Рнс. 1.6. Разделение | поверхностных и внут-риклеточных мембран §
тромбоцитов с noil мощью электрофореза ^ в свободном потоке [112].
Рисунок иллю-i, стрирует повышение ^ качества разделения после обработки
мембран нейрачннидазой и включения ЭДТА в состав градиента плотности
сорбитола, в котором проводят фракционирование (по* дробности см. в
тексте).
Органеллы и мембраны животной клетки
37
боциты, разрушенные ультразвуком, фракционировали в линейном (1-3,5 М)
градиенте плотности сорбитола, и полученные смешанные препараты мембран
разделяли с помощью электрофореза в свободном потоке [112]. Из рисунка
видно, насколько важна предварительная обработка клеток нейраминидазон:
качество разделения повышается настолько, что появляется возможность
охарактеризовать очищенные мембранные фракции по их ферментативной
активности.
Методика электрофореза в свободном потоке слишком сложна технически, и мы
не можем описать ее здесь достаточно полно. Отметим лишь некоторые
практические моменты.
1. Для повышения воспроизводимости результатов и предотвращения агрегации
необходимо тщательно обработать наносимый препарат, а именно - освободить
его от катионов.
2. Как видно из рис. 1.6, предварительная обработка препарата с помощью
ЭДТА способствует дальнейшему фракционированию поверхностных мембран
тромбоцитов.
3. Обработка препарата трипсином в низкой концентрации (0,5 мкг/мл) тоже
может способствовать разделению частиц, например эндосом и лизосом.
4. Разрешение улучшается при повышении напряжения - если, конечно,
осуществляется необходимый контроль за температурой и электрическими
параметрами системы (это возможно в последних моделях аппаратов).
Аппараты для электрофореза в свободном потоке довольно дороги, поэтому
были разработаны альтернативные электрофоретические методы. Например,
электрофорез в агарозных гелях (концентрация 0,15-0,3%), используемый в
основном при аналитических исследованиях, применяется и в препаративных
целях, особенно при разделении мелких окаймленных везикул и везикул с
гладкой поверхностью [113]. Применение этого метода в качестве
препаративного ограничивается в основном сложностью элюции частиц с геля;
правда, для этого можно использовать устройство для непрерывной элюции с
откачиванием из накопительного резервуара [114, 115] (рис. 1.7).
3.5. Иммуноаффинные методы
Эта группа методов отличается от всех описанных ранее тем, что в их
основе лежат различия не в физических, а в биологических свойствах
разделяемых компонентов. Иммуноаффинные методы обладают рядом
преимуществ: их можно применять для разделения малых количеств материала,
разделение осуществляется быстро и с высоким выходом. Очень важна
ориентация везикул: удается выделить плазматические мембраны, у которых
ориентация соответствует таковой в целой клетке.
38
Глава 1
Подробное описание методов и состояния дел в этой области можно найти в
