Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
30 мнн.
6. Снова экстрагируют осадок буфером 3 и NaCI, как описано в п. 5, но без
добавления восстанавливающего агента. Центрифугируют при 1600 g 30 мин,
чтобы получить фракцию ядерных оболочек, содержащую в основном
единообразные пустые, как правило, сферические структуры.
1) Из работы [1221.
производимость результатов и способы контроля протеолитиче-ской
деградации при выделении, описаны в работе [123].
Ядерные оболочки не несут никаких других специфических маркеров, кроме
нуклеозидтрифосфатаз; некоторые из них стимулируются ро1у(А+)мРНК [124],
а также специфическими полипептидами [122]. Такой морфологический маркер,
как ядер-ный поровый комплекс, биохимически пока не охарактеризован.
Очевидная непрерывность наружной ядерной мембраны и эндоплазматического
ретикулума обусловливает и общность их ферментного состава; в качестве
примера можно привести глюкозо-
6-фосфатазу.
5.2. Митохондрии
Митохондрии выделяют из многочисленных источников стандартными методами
[125]. Субфракционирование их для получения внутренних и наружных мембран
и компонентов матрикса проводят после замораживания - оттаивания
препарата и или обработки ультразвуком [126]. Прн обработке ультразвуком
стандартного осадка митохондрий, суспендированных в среде.
Органеллы и мембраны животной клетки
43
содержащей 1,2 М сахарозу и 2 мМ АТР (10 мг мембранного белка на 1 мл),
происходит разрушение митохондрий, а после центрифугирования в
ступенчатом градиенте плотности сахарозы наружные мембраны
концентрируются в полосе 0,45-1,12 М сахарозы, внутренние мембраны и
компоненты матрикса собираются в осадке, под нижним слоем с концентрацией
сахарозы 1,2 М, а промежуточная везикулярная фракция - между двумя
предыдущими, в полосе 1,12-1,20 М [126]. Маркерами внутренних
митохондриальных мембран служат ферменты - переносчики электронов
(Приложение II). Наружная митохондриальная мембрана, которая при
фрагментации образует везикулы, сходные по плотности и морфологии с
везикулами из плазматических мембран, содержит моноаминооксидазу. Описан
также "микро"-метод выделения наружных митохондриальных мембран из печени
крысы [127].
5.3. Лизоеомы
Лизоеомы - это органеллы, участвующие в протеолизе и содержащие до 50
гидролитических ферментов, активных при низких значениях pH. В число этих
ферментов входят различные фосфатазы, нуклеазы, гликозидазы, протеазы,
пептидазы, суль-фатазы и липазы [116].
Все методы выделения лизосом направлены на минимизацию перекрестного
загрязнения митохондриями и пероксисомами. Мы уже приводили примеры
разделения лизосом и других органелл: разделение в градиенте перколла
(разд. 3.1.1), путем изменения плотности органелл (разд. 3.1.2) и с
помощью электрофореза в свободном потоке (разд. 3.4). Разработаны и
другие методы. Это выделение с использованием комплекса железо- сорбитол
- лимонная кислота (АВ Astra, Sweden) и коллоидного золота (средний
диаметр 25 нм), инъецируемых внутримышечно; эти реагенты накапливаются в
лизосомах печени, увеличивая их плавучую плотность [128]. Можно увеличить
плотность лизосом и более прямым способом, добавляя в среду для
гомогенизации фосфат натрия до концентрации 10 мМ [129].
Однако более широкое распространение нашли способы очистки лизосом и
пероксисом с использованием веществ для получения изоосмотических
градиентов, особенно метризамида и найкоденза (см. ниже). Рассмотрим
вкратце, как получают легкую митохондриальную фракцию.
1. Гомогенизируют печень крысы, используя гомогенизатор Поттера -
Элвехейма (1000 об/мин, ~5 циклов), при соотношении 1 г ткани на 3 объема
0,25 М раствора сахарозы и центрифугируют гомогенат при 1000 g в течение
10 мин в роторе Sorvall SS-34 или аналогичном ему.
44
Глава 1
2. Собирают супернатант и суспендируют осадок в трех объемах 0,25 М
сахарозы. Центрифугируют при 1000 в течение 10 мин и объединяют этот
супернатант с предыдущим.
3. Центрифугируют объединенный супернатант при 3000 g в течение 10 мин,
затем образовавшийся супернатант центрифугируют при 10 000g в течение 20
мин, чтобы получить "легкую митохондриальную" фракцию. Эта грубая фракция
обогащена лизосомами и митохондриями, но содержит также мембраны аппарата
Гольджи, пероксисомы и фрагменты эндоплазматического ретикулума.
4. Ресуспендируют этот осадок (с помощью гомогенизатора Даунса) в 45%-ном
(1,25 г/мл) изоосмотическом растворе метризамида, чтобы получить
плотность 1,18 г/мл (детальный расчет плотности представлен в разд. 3.1)
и объем примерно 10 мл.
5. Наслаивают сверху (каждый слой по 6 мл) растворы метризамида 30, 26,
24 и 19% (1,16, 1,145, 1,135 и 1,105 г/мл) и центрифугируют в течение 2 ч
при 97 000 g (ротор Beckman SW28 или аналогичный). Лизоеомы
концентрируются в слое с плотностью 1,105-1,135 г/мл [75].
Выход мембран 0,5-1,0 мг белка на 1 г сырого веса печени считается
удовлетворительным. Как и при выделении лизосом из почек с помощью
градиента перколла (разд. 3.1), удельная активность лизосомных ферментов-
