Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 21

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 15 16 17 18 19 20 < 21 > 22 23 24 25 26 27 .. 191 >> Следующая

перистальтическому насосу.
7. Объединяют фракции, имеющие плотности 1,095-1,117 и 1.117-1,135 г/мл,
чтобы получить фракцию эндосом. Ести клетки печени поглотили путем
эндоцнтоза меченные радиоактивным иодом лиганды (например, асиатогли-
копротенны, полипептидные гормоны), которые были введены на 2-10 мин в
портальную вену, то эти соединения обнаруживаются в нерасщепленном виде в
материале с указанными плотностям. Связь между концентрацией сахарозы и
плотностью раствора приведена в Приложении I.
8. Субфракционируют эндосомы, используя градиенты найкоденза (разд.
3.1.1.). Получают фракции аппарата Гольджи (обедненные эндосомами),
собрав рыхлую часть осадка (п. 4), и ресуспендируют в слабо притертом
гомогенизаторе Даунса в 50 мл 39%-ной (в/о) сахарозы. Разливают эту
суспензию в шесть центрифужных пробирок на 38 мл (Beckman SW28), а сверху
наслаивают равные объемы следующих растворов сахарозы: 29,5%, 20.5 и 8%.
Центрифугируют при 100 000 g 3 ч и собирают тяжелую фракцию аппарата
Гольджи в полосе 29,5-39%, а промежуточную фракцию - в пологе 20,5-29,5%.
протеолитических ферментов в везикулах низкой плотности. Эндосомы не
содержат тех.ферментов-маркеров, которые характерны для внутриклеточных
органелл и мембран [77, 78, 84, 150]. Их трудно полностью отделить от
компонентов аппарата Гольджи из-за близости плотностей. Маркером
эндосомных фракций печени может служить активируемая моненсином Mg2_-
.ATPa-за - протонный нанос, ответственный за подкисление содержимого
эндосом [77]. Анализ мембран эндосом показал, чтс они ближе по своим
свойствам к плазматическим мембранам чем
Органеллы и мембраны животной клетки
51
какие-либо другие мембраны, поскольку содержат холестерол и сфингомиелин;
однако в мембранах эндосом присутствует меньше белков, чем в
плазматических мембранах [119].
В настоящее время охарактеризованы в основном эндосом-ные мембраны печени
и описаны методы получения их из клеток в культуре [151], макрофагов [49,
50] (табл. 1.5) и других клеток.
5.8. Плазматические мембраны
Плазматическая мембрана - это, по-видимому, наиболее сложная и
дифференцированная клеточная мембранная система, представляющая собой
непрерывную совокупность функционально различающихся областей. Особенно
это относится к клеткам тех тканей и органов, где апикальные и
базолатеральные зоны разделяются областью плотного контакта и
обнаруживают различия в биохимических свойствах [4, 5]. Кроме того,
существуют также микродомены, такие, как микроворсинки и окаймленные ямки
(разд. 5.6), а также различные типы межклеточных контактов. Доменная
организация просматривается также в изолированных клетках в культуре.
Было осуществлено разделение и биохимический анализ плазматических
мембран клеток HeLa [7]. лимфоцитов [152, 153] и яйцеклеток китайского
хомячка [154].
Методики получения плазматических мембран исключительно разнообразны, и
здесь можно говорить только об основных направлениях их развития. В
таблице 1.13 приведен список работ, посвященных выделению плазматических
мембран и других фракций из разных тканей, органов и клеток в культуре.
1. Условия гомогенизации тканей и клеток при выделении плазматических
мембран следует тщательно выбирать и жестко контролировать. Во время
гомогенизации может произойти разрушение плазматической мембраны и
образоваться полидис-персная смесь частиц с изменяющимися физическими и
биохимическими свойствами; это значительно затруднит дифференциальное
центрифугирование. Основное направление, которого следует придерживаться,
работая с тканями и органами, состоит в подборе способа гомогенизации,
позволяющего получать крупные мембранные фрагменты, осаждающиеся при
низкой скорости (вместе с ядрами). Везикулы плазматической мембраны,
находящиеся в микросомной фракции, очистить гораздо труднее.
2. Разработаны быстрые методы выделения плазматических мембран, которые
позволяют обойтись без субклеточного фракционирования. Они основаны на
высвобождении в среду (разд. 2.1.1) или присоединении к твердой фазе
(разд. 2.1.2)
4*
52
Глава 1
участков клеточной поверхности. Эти методы применяются только в случае
суспендированных клеток. Кроме того, существует опасность, что
отделившиеся от клеток везикулы будут нерепрезентативными в смысле
состава мембран, а везикулы, присоединенные к твердому субстрату
(например, к шарикам, покрытым полилизином), будет трудно освободить.
3. Большие успехи достигнуты при выделении плазматических мембран
благодаря использованию изоосмотических градиентов перколла, найкоденза и
т. д.; особенно эффективны эти методики при выделении плазматических
мембран из постъядер-ной фракции (разд. 3.1.1). Хотя выделение,
осуществляемое с помощью этих новых материалов для градиентов, бесспорно
выигрывает в скорости, необходимо иметь в виду, что фракции, так или
иначе собираемые из легкой области градиента (в перколле это плотности
1,02-1,04 г/мл), по-видимому, загрязнены мембранами эндосом и аппарата
Предыдущая << 1 .. 15 16 17 18 19 20 < 21 > 22 23 24 25 26 27 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed