Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
гл. 3.
4. Идентификация и оценка чистоты субклеточных фракций
4.1. Определение ферментов-маркеров
Вся практика субклеточного фракционирования основывается на предпосылке,
что каждая органелла или сеть мембран
Рис. 1.7. Аппарат для электрофореза в агарозном геле, позволяющий
увеличить выход маленьких органелл и частиц. Этот аппарат является
модификацией стандартного аппарата для горизонтального электрофореза.
Насосное устройство позволяет собирать компоненты по мере их поступления
в накопительный резервуар. Внизу слева показан накопительный резервуар
крупным планом; внутренняя сторона трубок срезана, чтобы обеспечить
прямой проток буфера через резервуар перпендикулярно направлению движения
частиц при электрофорезе. Этим методом разделяют и собирают окаймленные
везикулы (см. текст). Используемый буфер имеет следующий состав: 0,02 М
4-морфо-линоэтансульфоновая кислота (МЭС), 0,03 М фосфат, 0,25 М
сахароза, pH в диапазоне 6,5-7,8. Концентрацию агарозы варьируют от 0,15
до 0,2%. Наносимые образцы должны содержать в основном везикулы малого
диаметра, суспендированные в небольшом объеме буфера МЭС, содержащего 6%
сахарозы и 6% фиколла-70 (Sigma). При напряженности электрического поля
на геле 1,0 В/см (толщина слоя агарозы 1 см) скорость потока составляет
12 мл/ч. Подробности см. в работах [114, 115].
Органеллы и мембраны животной клетки
39
содержит такие компоненты или обладает такими свойствами, которые
обеспечивают их уникальность [116]. Действительно, ферменты-маркеры, как
было предсказано де Дювом, локализуются преимущественно в конкретных
органеллах и впоследствии неизменно обнаруживаются в тех мембранах, с
которыми они были ассоциированы. Необходимым условием исследований
(особенно аналитических) гомогенатов тканей является регистрация
активности целого спектра маркеров, что позволяет составить таблицу
распределения активностей. Эта таблица дает возможность оценить
распределение и активность субклеточных маркеров, обогащение ими по
сравнению с гомогенатом и степень загрязнения другими клеточными
компонентами (см. также гл. 2). Маркерами преимущественно служат
ферменты; в отдельных случаях данные, полученные на основании определения
их активности, подкрепляются с помощью химических маркеров; применяют
также радиоактивно меченные маркеры (в основном для плазматической
мембраны). Морфологический контроль чистоты фракций осуществляется, как
правило, на качественном уровне. Методы, позволяющие количественно
оценить состав субклеточных фракций на основании их морфологии,
рассмотрены в гл. 2.
Конструктивность данного подхода иллюстрируется тем, что с его помощью
были выделены основные органеллы и мембраны из многих животных клеток
(см. табл. 1.13), однако метод имеет и свои недостатки. Так, установлено,
что хотя большинство маркеров имеет наибольшую концентрацию в одном из
клеточных компартментов, они могут присутствовать (правда, в меньшем
количестве) и в других компартментах. Кроме того, существует
последовательность этапов обновления мембран - процесса, в ходе которого
белки и липиды перемещаются от места синтеза к месту функционирования и
затем в компарт-мент, где происходит их деградация. Гетерогенность
мембран может быть обусловлена и компартментацией сложных органелл,
например аппарата Гольджи и плазматической мембраны, с образованием
мембранных доменов. Об этом свидетельствуют результаты аналитического
центрифугирования гомогенатов тканей [117].
4.2. Выбор маркеров и критерии их использования
В Приложении II приведены данные о первичной субклеточной локализации
стандартных ферментов-маркеров. Применимость каждого из этих маркеров
варьирует в зависимости от типа клеток. В качестве примера можно привести
глюкозо-6-фосфатазу, которая является маркером клеток, осуществляющих
глюконеогенез. Организация плазматической мембраны
40
Глава 1
тканевых клеток в функциональные домены с различными биохимическими
свойствами может привести к появлению маркера в более чем одной зоне
градиента плотности; это связано с дифференцированной локализацией
ферментов в плоскости мембраны и обособлением ее участков в зоне тесного
контакта с эпителием. Так, фрагменты плазматической мембраны,
происходящие из области микроворсинок, в растворе сахарозы имеют
плотность 1,12-1,14 г/мл, а фрагменты, происходящие из латеральной
области, содержащей зоны контакта, -1,16-1,18 г/мл [4]. Потеря наружной
митохондриальной мембраны во время субклеточного фракционирования может
повлечь за собой появление, помимо интактных митохондрий с плотностью
1,19- 1,21 г/мл, мембранных везикул с плотностью 1,12-1,14 г/мл.
4.2.1. Ферментные мариеры
К маркерам этого типа относятся обычно сравнительно стабильные ферменты,
активность которых достаточно высока и ее удобно измерять. Обычно эти
измерения проводят как можно быстрее после выделения; образец при этом
хранят при 4°С и не замораживают. Галактозилтрансферазную активность
