Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Плотности образцов в градиентах из иодированных материалов рассчитывают
следующим образом. Если i]- коэффициент преломления, то плотность (г/мл)
при 20°С равна 3,4531] - 3,601 для метризамида, 3,2871] - 3,383 для
найкоденза (с NaCI) и 3,4Юг] - 3,555 для найкоденза (с сахарозой).
Раствор сахарозы изоосмотичен (0,25 М), а концентрация NaCI составляет
0,15 М.
Органеллы п мембраны животной клетки
27
Таблица 1.6. Значения плотности, при которых происходит уравновешивание
субклеточных фракций в градиентах найкоденза или сахарозы
Плотность, г/мл
Субклеточная фракция сахароза найкоденз1)
Энтероциты мэрской свинки 1,16-1,19
Митохондрии 1,19-1,21
Лизоеомы 1,20-1,21 1,14-1,17
Плазматические мембраны 1,14-1,16 1,11-1.15
Эндоплазм этический ретикулум 1,10-1,23 1,11-1,18
Печень грызунов
Ядра >1.30 1,23
Эндосомы 1,11-1,13 1,09-1,11
Пероксисомы 1,23 1,22
!) Найкоденз в 0,25 М растворе сахарозы.
Сравнительные данные по плотностям, при которых происходит
уравновешивание разных субклеточных фракций в градиентах найкоденза и
сахарозы, приведены в табл. 1.6.
3.1.2. Изменение плотности разделяемых компонентов
Скорости седиментации и плотность различных субклеточных компонентов
довольно близки (рис. 1.2). Это привело к необходимости создания подходов
для избирательного их изменения. Все эти подходы можно разделить на две
основные категории. К первой относятся методы с применением реагентов,
которые избирательно связываются с группами, присутствующими в одних
мембранах и отсутствующими в других. Ко второй относится целый спектр
методов, с помощью которых внутрь везикул вводят определенные вещества
или направленно изменяют содержимое везикул, вследствие чего сильно
меняются их седимента-ционные свойства (скорость седиментации/плотность).
Мембранные модификаторы
Преимущественное связывание дигитонина с холестеролом позволяет увеличить
плотность богатых холестеролом мембран без заметной солюбилизации
интегральных белков. Оптимальное увеличение плотности плазматических
мембран происходит при эквимолярном соотношении между дигитонином и
холестеролом. Если содержание холестерола во фракциях неизвестно
(например, в мембранах из мышц), дигитонин берут из расчета 0,1 мг на 1
мг белка [79]. Обработка дигитонином постъядерной фракции лимфоцитов
приводит к заметному смещению пиков актив-
28
Глава 1
ностей 5'-нуклеотидазы, щелочной фосфодиэстеразы и лейцин-аминопептидазы
в сторону больших плотностей, тогда как пик активности
галактозилтрансферазы сдвигается незначительно (см. Приложение II, где
говорится о локализации субклеточных ферментов-маркеров). Напротив,
положение пиков маннозил-трансферазы (маркера гладкого эндоплазм
этического ретикулу-ма), цитохромоксидазы и N-ацетпл-р-глюкозаминидазы не
изменяется [80].
Используется следующая методика. Определяют содержание холестерола в
мембранах (например, с помощью газовой хроматографии липидных экстрактов
фракций; гл. 4). Добавляют раствор дигитонина (0,3%) к перемешиваемой
субклеточной фракции в таком количестве, чтобы молярное отношение
днгитони-
1
1 1 т
во -
1
I во
о-
1
20
Р
1,036 -
1,110 -
1133 -
1,165 -
Фракция
1
2
3
6
5
i
? Сукцинат-INT-редуктаза
g Арилсулыратаза
60 -
I
I
Л
1
Нот фракции
Рис. 1.3. Разделение митохондрий и лизосом нз клеток почек в градиенте
перколла [51]. Грубую "митохондриально-лизосомную" фракцию наслаивают на
градиент перколла (см. текст). Плотность определяют с помощью специально
окрашенных гранул. Фракцию 4 (наиболее мутная полоса) отбирают с помощью
шприца, разводят раствором сахароза/ЭДТА и центрифугируют при 3000g 10
мин, чтобы осадить лизоеомы (темный осадок). Гранулы перколла при таких
низких скоростях не осаждаются.
Органеллы и мембраны животной клетки
29
на к холестеролу составило 1:1. Конечная концентрация дигн-тонина .не
должна превышать 0,01%, иначе может произойти солюбилизация мембранных
компонентов и появиться утечка в замкнутых везикулах.
Изменение содержимого везикул
1. Митохондрии. При инкубации фракции синаптосом мозга после
гипотонического шока в растворе, содержащем 1 мМ л-иод-нитротетразолий и
80 мМ сукцинат натрия, pH 7,4, в течение 20 мин при 3°С внутри
митохондрий образуются кристаллы фор-мазана, в результате чего плотность
становится выше, чем у плазматических мембран синаптосом. Кроме того, при
этом образуются сшивки между постсинаптическими компонентами, происходит
их стабилизация, протекают процессы, способствующие их выделению [81].
Обработка гомогената из печени крысы 10 мМ фосфатом калия увеличивает
скорость седиментации митохондрий, не влияя на осаждение лизосом, что
позволяет очищать последние в градиенте плотности перколла [82].
2. Т-трубочки. Хорошо разработана методика, основанная на заполнении
везикул оксалатом или фосфатом кальция. Это позволяет отделить везикулы,
происходящие из Т-трубочек, от других ретикулярных или сарколемных
мембран микросомной фракции из мышц (рис. 1.4). Са2+-АТРаза проявляет
