Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
тальным измерением F и вычислением В по разности [Аг*]0—F и, наоборот, экспериментальным измерением В и определением F по разности [Аг*]о—В.
При проведении РИА оба эти пути теоретически равноценны, так как реально регистрируемый сигнал (распад/мин), полученный от одной и той же концентрации связанной или свободной метки, одинаков. При проведении же ИФА теоретически не исключена вероятность, что активность фермента в комплексе иммобилизованное антитело — антиген-фермент будет отлична от его активности в несвязанном конъюгате. В этом случае регистрация одного и того же сигнала на твердой фазе и в растворе не может служить однозначным свидетельством о равном перераспределении начального количества конъюгата. Другими словами, экспериментально определив F и вычислив значение В как разность, получим истинное соотношение В/F, но, экспериментально измерив В (исходя из неизменности каталитической активности фермента в комплексе) и вычислив F, можно получить значение B/F, ие отражающее реального перераспределения меченого антигена. Предположение об изменении активности фермента может быть подтверждено или отброшено только на основе проведения дополнительных экспериментов. Наиболее простым из них является одновременно определение В экспериментально и как разность ([Аг*]0—F). Совпадение полученного и вычисленного значения В
свидетельствует в пользу неизменности активности фермента в иммобилизованном комплексе.
Эти же рассуждения правомерны и при откладывании по ординате значения В в процентах от начальной концентрации конъюгата. Недостатком последних графиков является отсутствие информации об абсолютном значении реально регистрируемого физического параметра. Например, масштаб ординаты графиков (B/F-^[Ar]0) может быть в диапазоне (0—1) как в случае, когда максимальное значение регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции составляет 1 оптическую единицу (о. е.), так и 0,05 о. е., хотя получение достоверных результатов анализа по второму графику практически невозможно. Та же ситуация возникает при представлении результатов в координатах (% В^[Аг]0), если авторы не указывают, какому реально измеряемому значению соответствует процент максимального связывания.
Аналогичное представление данных возможно и в тех случаях, когда ИФА проводят с использованием высокоочшценных полнили моноклональных антител, либо их РаЬ-фрагментов.
Иная ситуация возникает, когда в ИФА применяют меченную ферментом глобулиновую или IgG-фракцию, содержание антител в которых точно неизвестно и может варьировать в довольно широких пределах. Как правило, более 80% меченых IgG в таких конъюгатах неспецифичны к определяемому антигену. В этих случаях возможна детекция только тех меченых молекул антител, которые в ходе анализа образовали специфический комплекс с антигеном на твердой фазе. На ординату калибровочного графика при этом наносят регистрируемый параметр, пропорциональной концентрации ферментной метки на носителе (например, о. е., о. е./мин и т. д.).
Калибровочные кривые в широком диапазоне концентраций антигена в стандарте, как правило, имеют нелинейный вид. При логарифмическом масштабе на оси абсцисс графики приобретают сигмоидную форму, при арифметическом — гиперболическую. В некоторых случаях целесообразно перестраивать калибровочный график в координатах, в которых он имеет линейный вид. Чаще всего это необходимо при машинной обработке результатов анализа, которая проводится на простых ЭВМ. Сложный вид графика при этом может приводить к значительному увеличению времени счета. Наиболее простым подходом для линеаризации сигмоидных кривых является представление данных в координатах (logit y-f-log[A]0), где У— регистрируемый или расчетный параметр, изменяющийся пропорционально начальной концентрации
антигена; функция logit У=1п ^ Y . Отметим, что спрямление в
этих координатах наблюдается во многих, но не во всех случаях. При ручной обработке результатов искусственная линеаризация
не является необходимой, так как при переходе от одних координат к другим реальная точность и чувствительность анализа, естественно, не меняется, но их визуальная (по графику) оценка затрудняется, ибо утрачивается связь с измеряемым физическим параметром.
§ 2. Определение антител
В плане интерпретации результатов определение антител представляет более сложную задачу, чем определение антигенов.
Ответить на вопрос, какая концентрация антител, специфичных к данному антигену, находится в исследуемом образце, можно только на основе графика, откалиброванного по некоторому стандарту антител. При получении такого «стандартного» препарата возникает ряд сложностей. Во-первых, антитела необходимо выделять в высокоочищенном состоянии, чтобы иметь возможность охарактеризовать концентрацию препарата. Для этого используют метод иммуноадсорбции, что, в свою очередь, определяется доступностью очищеипого агента в количестве, необходимом для приготовления иммуносорбента.
Кроме того, приготовление стандарта зависит от того, какой класс антител необходимо измерять в ходе анализа. Далее встает проблема наличия свободной от антител сыворотки для приготовления разведений стандарта, которая далеко не во всех случаях может быть решена просто.
