Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Аналогичный эффект наблюдается и при наличии процесса неспецифического взаимодействия, который обусловлен связыванием меченого антигена избытком центров, обладающих меньшей константой связывания, чем антитела. Для подавления роста вклада неспецифического связывания (или влияния низкоаффинных антител) можно рекомендовать использовать в анализе концентрацию меченого антигена, при которой связывающие центры антител заполняются не более чем на 60—70% или, в линейном приближении, [Аг*]о=^ l/(&i*T) (при выбранном оптимальном времени Т).
Рис. 43. Теоретические калибровочные кривые при концентрациях меченого антигена 0,3 нМ (а) и 3 нМ (б):
Ат„=2 нМ; **j=2 • 106 м-1 • с-1; = 10—4 с-1; *=20 мии
Возможна также и ситуация, в которой уменьшение [Аг*]о также может привести к искажению калибровочной кривой. Допустим, что в анализе используются высокоаффинные антитела (/С*>1ДАт]0). Тогда при низких значениях [Аг*]0 меченый антиген может практически полностью связаться с антителами даже при условии, что концентрация свободных центров связывания существенно меньше [Ат}0. Это приведет к тому, что рост концентрации свободных центров связывания’ не будет сопровождаться увеличением связывания меченого антигена, следствием чего будет появление плато в начальной части калибровочной кривой, т. е. нижний предел обнаружения антигена повысится. Улучшить чувствительность в такой ситуации можно увеличением [Аг*]0 до значений, равных или превосходящих [Ат]0 (рис. 43).
В большинстве случаев применяемые в ИФА антитела двухвалентны и процессы последовательного связывания первого и
второго антигенов могут характеризоваться разными кинетическими и равновесными константами.
При наличии отрицательной кооперативности, т. е. когда связывание антигена одним активным центром антитела приводит к затруднению второго взаимодействия, поведение системы, очевидно, близко к рассмотренному случаю гетерогенной популяции антител, состоящей из одновалентных фракций с константами, равными константам первого и второго взаимодействий.
Большой интерес для метода последовательного насыщения представляет анализ эффекта положительной кооперативности. В этом случае на калибровочной кривой может наблюдаться плато или даже «колокол» в области низких концентраций определяемого антигена (рис. 44).
Чтобы объяснить этот эффект, рассмотрим изменение скорости связывания меченого антигена в течение времени. В отсутствие кооперативности эта зависимость описывается кривой, монотонно убывающей к нулю по мере заполнения активных центров антител. При наличии положительной кооперативности, проявляющейся в изменении константы скорости взаимодействия, скорость связывания антигена антителами, прореагировавшими с одним активным центром, оказывается выше в расчете на одну молекулу, чем полностью свободными антителами. Следовательно, по мере связывания антигена на начальном участке рассматриваемой зависимости будет наблюдаться подъем.
Соответственно в методе последовательного насыщения связывание меченого антигена в отсутствие определяемого будет некоторое время происходить с меньшей скоростью, чем при частичном предварительном заполнении антител определяемым антигеном, следствием чего может являться увеличение концентрации связавшегося меченого антигена на начальном участке калибровочной кривой. На рис. 45 представлена расчетная калибровочная кривая, полученная при условии, что константа скорости комплексообразования для второго взаимодействия в 10 раз больше, чем для первого.
Рис. 44. Теоретический калибровочный график при наличии эффекта положительной кооперативности в связывании антигена двухвалентными антителами: [Ат]о=0,1 иМ; [Аг*]0==1 иМ; t—10 мин; кои-стаиты для первого связывания: jfei=?j*=
= 106 М-1-с-1; k_{=k*_l=3 • 10-4 c-ь для второго: = М—1 ¦ с—1; k_l=k*_l=3X
Х10-4 с-1
• Избежать «колокола» на калибровочной зависимости можно, очевидно, увеличением времени инкубации на второй стадии или увеличением концентрации меченого антигена.
§ 3. «Сэндвич»-метод
«Сэндвич»-метод основан на использовании иммобилизованных и меченых специфических антител и является одним из наиболее распространенных подходов для анализа поливалентных антигенов. Метод существует в нескольких модификациях. Наиболее широко распространенная включает две стадии. На первой определяемый антиген взаимодействует с иммобилизованными антителами, затем иммуносорбент промывают и добавляют меченые ферментом антитела, степень связывания которых со свободными детерминантами пропорциональна начальной концентрации антигена. Вторично промывают носитель, добавляют субстрат и регистрируют количество метки, связавшейся с иммуносорбентом (см. схему гл. 5, § 2).
В основе схемы лежат две последовательные реакции антиген-антитело. При этом теоретически предел обнаружения антигена в «сэндвич»-методе в меньшей степени зависит от константы связывания антител, чем в ранее рассмотренных схемах. Это объясняется тем, что сдвиг равновесия в сторону образования специфического комплекса даже при крайне низких концентрациях антигена может достигаться за счет избытка антител на каждой стадии анализа. Поэтому формально предел обнаружения антигена данным методом лимитируется только пределом детекции метки. Но реально значительное увеличение концентрации антител приводит к возрастанию вклада неспецифических взаимодействий, которые и ограничивают нижнюю границу определения содержания антигена.
