Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Вторая иммунохимическая стадия анализа включает взаимодействие меченых антивидовых антител со специфическим комплексом антиген — антитело, сформированном на носителе. Основные требования к этой реакции аналогичны рассмотренной ранее второй стадии «сэндвич»-метода анализа. Очевидно, что оптимальными являются условия, обеспечивающие линейную пропорциональность между концентрациями специфических антител в комплексе (которая изменяется от нуля до значения концентрации иммобилизованного антигена) и связавшихся с ними меченых антивидовых антител при минимальном фоновом сигнале.
• Для этого можно рекомендовать следующие меры:
1) концентрацию меченых антивидовых антител следует выбирать больше концентрации иммобилизованных антител (в том числе и неспецифических, оставшихся в системе в результате отмывки после первой стадии). В противном случае на рассматриваемой зависимости может наблюдаться плато или колоколообразный эффект, что приводит к s-образной форме калибровочного графика с загибом в области малых концентраций определяемого антигена (рис. 47);
2) длительность проведения второй стадии не должна существенно превышать время достижения равновесия реакции меченых антител со специфическими антителами. Инкубация после достижения этого равновесия может привести к уменьшению регистрируемого сигнала за счет диссоциации комплекса антител с иммобилизованным антигеном, что особенно существенно в условиях, когда начальная концентрация антигена много меньше 1JK-Кроме того, неспецифическое связывание антивидового конъюгата при увеличении длительности инкубации будет возрастать, приводя к увеличению фонового сигнала;
3) уменьшение относительного уровня фонового сигнала, обусловленного неспецифическим связыванием конъюгата, может достигаться также путем тщательной отмывки носителя после проведения второй стадии анализа. Так как прочность связи неспецифически адсорбированного конъюгата относительно невелика, то его отмывка должна происходить с большей скоростью и приводить к уменьшению его относительного вклада в результирующий сигнал. Однако следует учитывать, что для избежания потерь за счет диссоциации значительной части специфически связавшегося конъюгата промывки не должны быть длительными.
• Проведенное рассмотрение четырех широко используемых схем ИФА не претендует на полноту изложения, так как в качестве исходных предпосылок были взяты довольно простые приближения. Усложнение схем требует оперирования более громоздким математическим аппаратом. Целью этого раздела явилась попытка сконцентрировать внимание исследователей на моментах, прин-
ципиально важных для разработки и оптимизации методик анализа. Известную долю неудовлетворенности у читателей может вызывать тот факт, что оценка этих параметров проведена с использованием значений кинетических и термодинамических констант реакции антиген — антитело, значения которых в большинстве случаев неизвестны и требуют для их вычисления достаточно сложных экспериментов.
Несомненно, оптимизация любого метода ИФА может быть проведена (и в большинстве случаев проводится) чисто эмпирическим путем, так как ни одна теоретическая модель не может универсально описывать процесс взаимодействия различных молекул с антителами и учитывать множество факторов (pH, ионная сила, природа буфера и т.д.), реально на него влияющих. Но знание основных теоретических закономерностей позволяет правильно спланировать эксперимент и избежать многих ошибок при интерпретации его результатов.
Методы представления и обработки экспериментальных данных
На заключительной стадии проведения ИФА осуществляется измерение каталитической активности ферментной метки. При наличии отработанной методики анализа регистрируемый при этом параметр од позначно соответствует начальной концентрации измеряемого соединения и служит характеристикой его содержания. Единицы, в которых выражается регистрируемый сигнал, могут быть различны и зависят от метода определения ферментативной актив-сти (например, спектрофотометрический, флуориметрический, электрохимический, люминесцентный и т. д.). На основании полученных данных оператор должен сделать вывод, присутствует ли анализируемое соединение в пробе, и если да, то в какой концентрации. Этот этап является крайне ответственным, и для того чтобы максимально снизить возможность субъективных оценок результатов анализа, современные регистрирующие приборы для проведения ИФА оснащены микропроцессорами, с помощью которых рассчитывают концентрацию определяемого соединения в соответствии с заданной программой. Но пока что в большинстве случаев количественная интерпретация результатов зависит от опыта сотрудника, проводящего анализ.
Методами ИФА можно определять антигены и антитела. Методология представления результатов при этом отлична, поэтому рассмотрим эти случаи отдельно.
§ 1. Анализ результатов определения антигена
Количественную интерпретацию результатов определения антигена, как правило, проводят на основе калибровочного графика, по оси абсцисс которого откладывают концентрацию антигена в стандартном препарате, а по оси ординат — экспериментально регистрируемый в ИФА параметр. Очевидно, что правильность результатов зависит от качества стандарта и, в первую очередь, от точности определения в нем концентрации антигена.
