Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
4. Иммунорорбент промывают ФБ с той же скоростью до исчезновения
белка иа выходе из колонки. Белок определяют спектрофотометрически при
Я=280 им. Общий объем буфера для промывки—-200 мл.
5. Сорбированные на колонке с иммуносорбентом специфические антитела к IgG-человека элюируют 0,1 М глициновым буфером, pH 2,5, с 0,1 М NaCl фракциями по 3 мл. Элюированный раствор быстро подщелачивают до нейтральных значений pH.
6. Количество белка во фракциях определяют спектрофотометрически. Фракции, содержащие максимальное количество' белка, объединяют, диализуют против ФБ в течение 14—18 ч при 4°С.
7. Специфичность и титр выделенных специфических антител проверяют реакцией иммунопреципитации.
8. Выделенные специфические антитела используют для получения иммуноферментного конъюгата.
Концентрацию антител (С, мг/мл) в растворе определяют спектрофотометрически при А,=280 нм по формуле С=Л28о/1,3.
Получение конъюгата антител с пероксидазой хрена (Ат-ПХ)
1. Синтез конъюгата Ат-ПХ осуществляют перйодат-ным методом (см. гл. 7, § 2).
2. Конъюгат используют в рабочем разведении — 500 нг пероксидазы в 1 мл ТФБ. Расчет концентрации пероксидазы в конъюгате производят по формуле С=Л4оз-0,44 (мг/мл), где Лмз—оптическая плотность раствора при 403 нм.
Очистка вируса гриппа А(НгЫ2) и A(HiN\)
1. В работе используют вирусы А/Лен/54/1 (HiNi)P и А/Лен/385/80 (Н3^)Р, очищенные и сконцеитрироваииые методом адсорб-
* Перечислены реагенты, материалы и оборудование, необходимое только для проведения анализа. Реагенты и оборудование для получения антител и очищенных препаратов антигенов, указаны далее в соответствующих разделах методических рекомендаций,
ции—элюции иа формалииизироваииых эритроцитах и хроматографией иа пористом стекле.
2. Вирусы концентрируют центрифугированием в течение 1,5 ч при 20 ООО об/мин.
3‘. Вирусный осадок разводят в минимальном объеме.
4. Содержащую вирус жидкость разливают порциями по 0,5 мл во флаконы и хранят при —5ч—10°С.
Определение изменения уровня антител у людей,
вакцинированных гриппозной вакциной
1. В луику полистирольного планшета вносят по 100 мкл вируса гриппа A (H3N2) или A(HiNi), разведенного до концевой концентрации белка — 5 мкг/мл.
2. Планшеты оставляют для адсорбции иа 18—24 ч при 4°С.
3. Содержимое луиок сливают, отмывают от несвязавшегося вируса 3-кратно по 3 мин ТФБ.
4. Высушенные планшеты могут храниться в течение 2 месяцев при 4°С или 6 месяцев при —5-=—10°С.
5. Исследуемые сыворотки крови людей до и после вакцинацин гриппозной вакциной разводят в 500 раз ТФБ.
6. В первые лунки вносят по 100 мкл раствора ТФБ (контроль без сыворотки). В остальные лунки—по 100 мкл исследуемых парных сывороток (ие менее 3 повторов на образец).
7. Планшеты оставляют на 2 ч при комнатной температуре.
8. Содержимое лунок сливают, отмывают 3 раза ТФБ и подсушивают на фильтровальной бумаге.
9. В луики вносят по 100 мкл раствора конъюгата Ат-ПХ в ТФБ с концентрацией 500 нг/мл по пероксидазе.
10. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, затем отмывают три раза ТФБ.
11. В лунки вносят по 200 мкл свежеприготовленного субстратного раствора иа основе 5-АС (см. § 1 этой главы).
12. Планшеты оставляют на 40 мии при комнатной температуре и фото-метрируют продукт ферментативной реакции при Х=450 им.
Интерпретация результатов
1. Вычисляют разность (АА) между оптической плотностью сывороток после вакцинации и до вакцинации и среднеквадратичную ошибку а (см. гл. 10, § 3).
2. Иммунный ответ на вакцину считают положительным, если величина ДА равна или превышает трехкратную ошибку метода.
§ 3. Определение поверхностного антигена вируса гепатита В (HiBsAg)
HBsAg — один из основных белковых маркеров вируса гепатита В. Анализ иа наличие и динамику изменения концентрации этого белка необходим для контроля крови, предназначенной для переливания и приготовлении препаратов иммуноглобулинов, а также для дифференциальной диагностики заболевания гепатитом и проведения массовых эпидемиологических обследований.
В основу описываемой ниже методики положены результаты работы по созданию ИФА HBsAg (С, А, Аракелов и др., 1984) и регламент по производ-
ству иммуиофермеитиых наборов иа HBsAg, выпускаемых Горьковским НИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава РСФСР.
Определение проводится «сэндвич»-методом ИФА, включающим адсорбцию аитител против HBsAg иа полнстирольных планшетах и последующее взаимодействие аитигеиа сначала с иммобилизованными, а затем с меченными перокси-дазой специфическими антителами. Регистрируемая иа носителе ферментативная активность пропорциональна начальной концентрации аитигеиа и служит характеристикой его содержания.
