Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Используемый для калибровки стандартный препарат представляет собой раствор очищенного антигена определенной концентрации в той биологической жидкости, которая подлежит анализу. В тех случаях, когда это возможно, применяемая для приготовления стандарта биологическая жидкость (Например, сыворотка крови) предварительно должна быть очищена от эндогенного антигена. Способ очистки зависит от природы антигена. Многие гормоны могут быть удалены из сыворотки адсорбцией на угле. Более универсальным путем, пригодным для удаления из сыворотки любых антигенов, является иммуноадсорбция. После приготовления стандарты чаще всего лиофилизуют и хранят до использования при низкой температуре.
Стандарты бывают международные и внутренние. Внутренний стандарт может быть приготовлен в любой лаборатории. Но при этом следует помнить, что значения концентрации антигена в одном и в том же образце, измеренные в лабораториях, использующих разные внутренние стандарты, могут существенно отличаться. Для получения в разных местах сопоставимых результатов под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) утверждаются и создаются Международные стандарты, которые рассылаются в заинтересованные организации. Международный стандарт может быть получен в ограниченном количестве, поэтому при представлении такой возможности его используют для калибровки большой партии внутреннего стандарта, с которым и проводят дальнейшие исследования.
Анализ на основе калибровочных зависимостей сопряжен еще с одним нуждающимся в учете эффектом. Очевидно, что концентрации будут правильно измерены только в том случае,, если антиген в образце и стандарте связывается антителами идентично. В качестве примера представим, что при проведении анализа «сэндвич»-методом комплекс антител со стандартным антигеном Arj образуется с большей константой связывания, чем с исследуемым Аг2. Тогда одинаковый по величине сигнал будет регистрироваться при концентрации [Аг2] большей, чем [Arj, т. е. опре-деленно„е по калибровочному графику значение концентрации исследуемого антигена будет меньше истинной величины.
Неидентичность в свойствах антигенов может проявляться из-за видовых или тканевых различий, а также при существовании в исследуемой пробе нескольких ф<эрм антигена (например, молекула-предшественник, антиген-метаболит), каждая из которых обладает различным сродством к антителам. Эти вопросы следует анализировать в каждом конкретном случае отдельно с целью выбора правильной стратегии в приготовлении стандарта и интерпретации результатов анализа.
Форма представления калибровочного графика. На конечной стадии получения калибровочной зависимости экспериментатор в своем распоряжении имеет абсолютные значения регистрируемого параметра, соответствующие начальной концентрации антигена в стандарте. В дальнейшем форма графика, наглядность и удобство работы с ним зависят от того, что и в каком масштабе откладывается по осям.
Масштаб диапазона концентраций антигена в стандарте по оси абсцисс может быть выбран арифметическим или логарифмическим, что скажется на форме графика (рис. 49). Арифметический масштаб целесообразен при изменении концентрации определяемого соединения лишь в узком диапазоне. В широком диапазоне график имеет нелинейный вид, что затрудняет определение низких концентраций антигена, так как-начальный его участок сильно «сжат». В тех случаях, когда концентрация антигена в стандарте изменяется более чем на один порядок, лучше использовать логарифмическую шкалу.
Рис. 49. Вид калибровочного графика при логарифмическом (а) и арифметическом (б) масштабе абсциссы:
[Аг)о — концентрация определяемого антигена. А — регистрируемое в ИФА значение оптической плотности продукта ферментативной реакции
На оси ординат в ИФА также могут быть отложены различные величины. Чаще всего это непосредственно регистрируемый сигнал (например, при спектрофотометрическом методе детекции им обычно является оптическая плотность продукта ферментативной реакции, образовавшегося в системе за определенный интервал времени). Такая графическая интерпретация наиболее наглядна и позволяет быстро оценивать воспроизводимость результатов.
Возможность других способов представления ординаты зависит от методики анализа. Если при проведении ИФА используется меченый антиген, все молекулы которого обладают способностью взаимодействовать с антителами, то ордината графика может быть выражена в величинах, широко используемых в ра-диоиммунологическом анализе, а именно как процент связанной метки от начальной (или отношение концентрации связанной метки к свободной, свободной метки к связанной, связанной метки к исходной). Наиболее удобными для практических целей являются графики в двух первых координатах. Их форм-а сходна между собой и с графиками, приведенными на рис. 48. Однако в отличие от рис. 48 в этих случаях по оси ординат откладывается не экспериментальная, а расчетная величина и степень достоверности графика зависит от корректности расчета. Так, отношение концентраций связанного с антителами меченого антигена к свободным (В/F) может быть получено двумя путями: эксперимен-
