Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
щая это положение теоретическая зависимость приведена на рис. 45.
При увеличении времени инкубации концентрация связанных меченых молекул сначала возрастает, а затем резко снижается. Эффект снижения может быть вызван тем, что продиссоциировав-ший из комплекса антиген связывается избытком меченых антител, что сдвигает равновесие в сторону дальнейшей диссоциации (отметим, что при выбранных начальных условиях степень заполнения антител антигеном на первой стадии близка к 100%. При меньших степенях заполнения эффект будет менее резко выражен). При данных условиях требуется строгая оптимизация длительности второй стадии анализа. Общей рекомендацией в подобном случае является уменьшение времени до Т^ 1/&-I, при котором влияние процесса диссоциации будет незначительно.
Рис. 45. Теоретическая зависимость образования тройного комплекса в «сэндвич»-методе от длительности инкубации с мечеными антителами: [Ат]о“0,1 ИМ; 1Аг]о=0,1 иМ;
=3 нМ; *,=*1*=10“ *_,=
-fe*_,-10-s с-1
t'MUH
Рис. 46. Экспериментальная кинетическая зависимость в «сэндвич»-методе а-амилазы:
по оси абсцисс — время инкубации с меченными пероксидазой антителами; по оси ординат — оптическая плотность А прн А=450 нМ продукта пероксндаз-иой реакции; концентрация антигена для кривых / и 2 85 и 15 иг/мл соответственно
Экспериментальный график, подтверждающий возможность перегиба на кинетической кривой связывания меченых антител, приведен на рис. 46. Перегиб наблюдается на графике с высокой начальной концентрацией антигена (кривая 1) и отсутствует при низкой (кривая 2), что может быть обусловлено разной степенью заполнения антител на первой стадии анализа. Из сопоставления кривых 1 и 2 следует, что при неоптимальном времени инкубации с мечеными антителами (более 90 мин) регистрируемые сигналы при разных концентрациях антигена практически одинаковы, что
дает экспериментатору неверную информацию. При правильном выборе времени инкубации на второй стадии анализа («50 мин) определяемые концентрации соответствуют истинным. Следует отметить, что случай, подобный рассмотренному, наиболее вероятен при иммобилизации антител на непористых носителях, когда даже при высоких константах связывания соотношение 1/[Ат]0>/С соблюдается из-за крайне малых количеств белка на твердой фазе.
Рис. 47. Теоретическая колоколообразиая калибровочная кривая в «сэидвич»-методе (а) и экспериментальный график определения os-амилазы «сэндвичи-методом ИФА на полистирольных планшетах (б): для а— [Ат]0—0,1 нМ; [Ат*]0=0,1 нМ; А1=*_1=А*__1 = 10—3 с-1
Начальная концентрация меченых антител. Вторую стадию ана* лиза целесообразно проводить в условиях, приводящих к высокой степени заполнения связанного в комплекс антигена молекулами меченых антител, что способствует достоверному выявлению низких концентраций анализируемого вещества.
Степень заполнения можно регулировать начальной концентрацией меченых молекул. На практике не следует стремиться к насыщению конъюгатом более 90% молекул связанного антигена, так как дальнейшее увеличение практически не влияет на регистрируемый «специфический сигнал», в то время как вклад неспецифических эффектов может расти пропорционально концентрации меченого соединения.
Очевидно, что для достижения высоких степеней заполнения при любых начальных концентрациях антигена концентрация меченых антител должна быть много больше [Ат]о. При работе в диапазоне концентраций меченых антител меньше [Ат]о на кали-
бровочном графике при увеличении концентрации антигена может наблюдаться колоколообразная зависимость, известная в литературе под названием «хук»-эффект (англ. «hook») (рис. 47). Одной из причин наличия максимума на графике может являться блокировка меченых антител продиссоциировавшим антигеном. Если перегиб обусловлен этим, то эффект должен уменьшаться при возрастании концентрации меченых антител.
§ 4. Конкурентный метод с использованием меченых антивидовых антител
Данный подход находит широкое применение на практике, так как позволяет определять разные антигены (как моно-, так и полидетерминантные) с использованием одних и тех же меченых антител. Анализ проводят следующим образом. К иммобилизованному на носителе антигену добавляют определяемый антиген и специфические антитела. В процессе инкубации иммобилизованный и определяемый антигены конкурируют за центры связывания антител. В результате на носителе образуется комплекс антиген — антитело, концентрация антител в котором пропорциональна начальной концентрации определяемого антигена. После удаления избытка несвязавшихся компонентов к носителю добавляют меченые ферментом антивидовые антитела, образующие комплекс со специфическими антителами. После удаления избытка меченых антител регистрируют концентрацию метки на носителе (см. схему гл. 4, § 2).
В методе сочетаются принципы конкурентного и «сэндвич»-анализа, количественные закономерности которых рассмотрены ранее. В связи с этим, не останавливаясь на математических расчетах, .кратко суммируем основные рекомендации для оптимизации первой и второй стадий анализа.
