Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Как и в предыдущих случаях, проведем теоретический анализ некоторых закономерностей схемы для выявления параметров, которые целесообразно оптимизировать.
На первой стадии анализа происходит связывание антигена антителами, которое для определения низких концентраций [Аг]0 целесообразно проводить в равновесном режиме. Используя ранее введенные обозначения, эту стадию можно записать в виде *¦ ,
Лт-fAr-------АтАг (9.30)
*-i
После установления равновесия несвязавшиеся с антителами компоненты удаляют чаще всего путем промывания носителя с иммобилизованными антителами. В процессе промывки часть связавшегося антигена может диссоциировать и удаляться из системы. Количество адсорбированного антигена пропорционально времени
контакта промывающего раствора с сорбентом, из чего следует, что отмывку следует проводить по возможности быстро.
На второй стадии к иммобилизованному комплексу антитело—¦ антиген добавляют раствор, содержащий меченные ферментом антитела, после чего становится вероятным прохождение следующих процессов:
1) диссоциация связавшегося антигена в раствор:
АтАг Ат + Аг (9.31)
2) связывания меченых антител с антигеном в специфическом комплексе на носителе:
' *» .
АтАг 4- Ат* 1-----АтАгАт* (9.32)
*_2
3) диссоциация образовавшегося комплекса по связи с первыми антителами:
АтАгАт* ,......- Ат-f- АгАт* (9.33)
ka ^
4) связывание отделившегося комплекса (АгАт*) в растворе с мечеными антителами:
»«
АгАт* + Ат*-<------ Ат*АгАт* (9.34)
*-4
5) взаимодействие связавшегося на первой стадии, а затем перешедшего в раствор антигена с мечеными антителами:
Аг + Ат*^=± АгАт* (9.35)
*-5
Данные процессы описываются следующей системой уравнений:
¦ " = k1 [Ат] [Аг] -f- k-2 [АтАгАт*] — /• [АтАг] —
— &21АтАг][Ат*] (9.36)
d [АтАгАт 1—^2|АтАг] [Ат*]-)-Ла1Ат] [АгАт*] — dt
-(k-2+k-s) [АтАгАт*] (9.37)
- [Ат-^гАт*] = kt [АгАт*] [Ат*] - [Ат*АгАт*] (9.38)
Ld tAr^l 1.. — [Ат*] [Аг] -\-k-z [АтАгАт*] -f^-4 [Ат* АгАт*] — dt
— k-5 [АгАт*] — k4 [АгАт*] [Ат*] — k3 [АгАт*] [Ат] (9.39)
[Аг]0=[Аг] -}- [АтАг] ~f [ Ат*Аг] [Ат*АгАт] + [Ат*АгАт*] (9.40)
]Ат]0=[Ат] ~f [АтАг] + [АтАгАт*] (9.41)
[Ат*]0 = [Ат*] -j- [ Ат*Аг] +1 Ат*АгАт] -j- [ Ат*АгАт*] (9.42)
где [Ат*]о — начальная концентрация меченых антител, [Аг]0 —
концентрация определяемого антигена, связанного с иммобилизованными антителами после отмывки носителя.
В начальный момент времени на второй стадии [Аг]=0; [Ат* Аг]=[ Ат* Аг Ат]=[Ат* АгАт*]=0.
Приведем в качестве иллюстраций теоретические графики, полученные путем точного решения данной системы уравнения на ЭВМ.
При наличии антител данной аффинности и необходимости определять антиген в фиксированном диапазоне концентраций величинами, которые может варьировать экспериментатор, являются концентрации иммобилизованных и меченых антител и времена инкубации на первой и второй стадиях.
Как отмечалось выше, на первой стадии целесообразно проводить реакцию в равновесном режиме, выбирая максимально возможную концентрацию антител, не приводящую к значительному увеличению вклада неспецифических взаимодействий. (Отметим, что в ряде модификаций ИФА концентрация антител не может варьироваться в широких пределах. Например, при использовании в качестве сорбента полистирольных планшетов или пробирок эта величина лимитируется площадью поверхности носителя.)
Больший интерес представляет рассмотрение второй стадии.
Длительность реакции с мечеными антителами. После удаления несвязавшегося антигена и добавления меченых антител равновесие, установившееся на первой стадии, смещается ц происходит диссоциация комплекса антитело — антиген. Наибольшая степень диссоциации, очевидно, будет иметь место при значениях [Аг]о, приводящих к образованию специфического комплекса в концентрации, приближающейся к начальной концентрации антител, т. е. влияние диссоциации будет сильнее сказываться в правой части калибровочного графика. Кроме того, степень диссоциации зависит от соотношения концентрации и константы связывания антител. Например, при значении /С«*1/[Ат]0 и при [Аг]0»[Ат]0 после диссоциации в связанном с антителами состоянии остается примерно половина первоначально образовавшегося комплекса антигена ([Аг]0/2). При К1 /[Ат]0 влияние процесса диссоциации будет пренебрежимо мало. Но при работе в диапазоне 1ДАт]о^>^С время инкубации может значительно влиять на концентрацию молекул меченых антител, связавшихся в комплекс АтАгАт*, т. е. в конечном итоге на регистрируемый в ИФА сигнал. Иллюстрирую-
