Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 112

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 106 107 108 109 110 111 < 112 > 113 114 115 116 117 118 .. 123 >> Следующая

Реагенты, материалы и оборудование,
необходимые для проведения анализа
Антитела против HBsAg; положительный н отрицательный стандарты; специфические антитела, меченные пероксидазой (Ат-ПХ); компоненты для приготовления субстратной смеси иа основе о-фенилеидиамииа; ФВ; ТФБ; полистирольные планшеты для ИФА; автоматические пипетки; спектрофотометр.
Выделение антител против HBsAg
Для выделения антител используют высокоактивные аитисыворотки с титром не менее 1 :500 по реакции преципитации в геле (РПГ]К ие содержащие антитела к белкам нормальной сыворотки человека
1. Готовят колонку 2X15 см, заполняют ее DEAE-сефадексом А-50 и промывают 15—20 объемами 0,01 М фосфатного буфера, pH 8,0.
2. К 100 мл сыворотки, содержащей специфические аитнтела, добавляют 15 г (NH4)2S04 и оставляют иа иочь при 20°С.
3. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мии и растворяют в 25 мл Н20. Полученный раствор диализуют при 4°С дважды по 12 ч против Н20 и дважды по 17 ч против 0,01 М фосфатного буфера (pH 8,0).
4. Раствор осветляют при 5000 об/мин в течение 30 мин и наносят иа колонку с DEAE-сефадексом. Элюируют 0,01 М фосфатным буфером (pH 8,0).
5. Собирают фракции по 5 мл и определяют содержание в них белка спектрофотометр ическн при А,= 280 им.
6. Фракции, содержащие максимальное количество белка, объединяют, диализуют против физиологического раствора и спектрофотометрически определяют концентрацию белка.
Концентрация белка должна быть 8—12 мг/мл. При меиьшей концентрации необходимо довести ее до указанных значений, дл'я чего удобно использовать прибор для ультрафильтрации.
7. Прлученный препарат должен обладать удельной активностью ие менее
0,1 мг/мл на единицу титра по РПГ.
8. Препарат разливают по ампулам и хранят при —20°С.
Очистка HBsAg из сыворотки крови
1. Для получения очищенного HBsAg отбирают плазму с титром 1:8 и выше по реакции встречного иммуиоэлектрофореза (ВИЭФ), разводят в 2 раза физиологическим раствором и разливают во флаконы по 200 мл. Флаконы помещают в водиную баню с температурой 80±2°С и прогревают в течение 1 ч, затем флакоиы охлаждают в холодной, воде.
2. Образовавшийся во флаконе сгусток разделяют иа мелкие части стеклянной палочкой и переносит в стакан гомогенизатора, где разрушают при
2000 об/мин в течение 1 мии.
3. Полученную суспензию центрифугируют при 18 000 об/мин в течение 30 мии и затем собирают иадосадок.
4. К надосадочиой жидкости добавляют физиологический раствор до объема, в 2 раза превышающего объем исходной плазмы. Затем к полученной смеси добавляют 50%-иый раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ; Мг=6000) в физиологическом растворе до конечной концентрации 15%. Добавление необходимого количества ПЭГ производят небольшими порциями при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Смесь инкубируют 12—14 ч при +4°С.
5. Сформировавшийся осадок отделяют центрифугированием при
5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок сливают, а осадок растворяют в дистиллированной воде до 1/10 объема исходного материала. Растворение производят иа магнитной мешалке при +4°С.
6. Диализуют полученный раствор против Н20 дважды по 12 ч.
7. Раствор доводят до pH 2,3 добавлением 1 М НС1 и вносят кристаллический пепсин из расчета 100 мкг на 1 мл раствора. Смесь инкубируют в термостате при 37°С в течение 12—18 ч и нейтрализуют 1 N раствором NaOH до
pH 7,2—7,4.
8. К полученному раствору добавляют 20%-ный водный раствор твии-80 до концентрации 2% и инкубируют 4—6 ч при комнатной температуре.
9. Полученный раствор промывают двухкратным объемом физиологического раствора иа аппарате «Amicon» с фильтром ХМ-100 и концентрируют до 1/20 объема исходного материала.
10. Материал наслаивают по 2—3 мл на линейный градиент плотности сахарозы (от 15 до 30% в физиологическом растворе) в стаканах емкостью 35 мл. Центрифугируют при 23 000 об/мин в течение 14—18 ч. Затем градиент фракционируют и отделяют фракции первого белкового пика, определяемого на спектрофотометре при >.= 280 им, содержащие HBsAg.
И. Полученные фракции объединяют и диалнзуют против физиологического раствора 24—48 ч при +4°С с последующим концентрированием до содержания белка 0,1—0,2 мг/мл.
12. Собранный материал разливают в ампулы и хранят при —20°С.
13. Полученный препарат очищенного HBsAg контролируют: а) иа специфическую активность по ВИЭФ, величина которой должна быть не ниже 5 мкг на единицу титра; б) на полноту очнетки по РПГ. Полученный препарат не должен давать линий преципитации с антисывороткой к белкам плазмы человека. ¦
Приготовление конъюгата антител с пероксидазой хрена (Ат-ПХ)
Предыдущая << 1 .. 106 107 108 109 110 111 < 112 > 113 114 115 116 117 118 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed