Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
На первой стадии иммобилизованный и определяемый антигены конкурируют за центры связывания антител. Используя введенные ранее обозначения для данного случая [см. уравнение (9.13) ], можно записать:
[Аг10мин=5*{[Ат10 +К‘ 1Ат^+*** 1АтЬ2)} * (9-43>
где [Аг]о мин — минимально определяемая концентрация антигена; Ki — константа связывания с антителами иммобилизованного антигена; [At]i — равновесная концентрация свободных центров связывания антител в отсутствие определяемого антигена.
Для приближения к предельной чувствительности следует выполнять условия (см. с. 230):
r\ t\ i z
где В,- — равновесная концентрация антител, образующих комплекс с иммобилизованным антигеном в отсутствие определяемого антигена ([Ат]о=В,+[Ат^).
Рис. 48. Влияние концентрации иммобилизованного антигена иа калибровочные графики в методе ИФА с использованием меченых антивидовых антител:
а — теоретические графики: для кривых / и 2 концентрация иммобилизованного антигена составляет 10 и 1 иМ; остальные условия аналогичны: [Ат]0*=0,1 иМ; [At*]j = 10 нМ (начальная концентрация меченых антивидовых антител); Л*1!=Лг1*=3 -106 М-1 • с-1; &_j =
Ю“* с—1 (где -fej и — константы скорости связывания специфических антител с и*л.оь,1льзоваиным антигеном и меченых антивидовых антител с комплексом); время инкубации с конъюгатом 7=20 мин; б — экспериментальные графики определения тестостерона данным методом ИФА с использованием меченных пероксидазой антивидовых антител: концентрация конъюгата тестостерон — белок при адсорбции на полистирольиые планшеты для кривых 1 и 2 составляет 0,5 н 0.05 мкг/мл соответственно; по осн ординат — оптическая плотность продукта пероксидазной реакции
Физический смысл третьего условия состоит в том, что иммобилизованный антиген может значительно смещать равновесие реакций, проходящих в растворе (и тем самым существенно ухудшать калибровочную кривую по сравнению с кривой титрования), только в случае, если он способен связывать значительную часть антител, за которые идет конкуренция. С другой стороны, теоретически выгодное значительное снижение концентрации комплекса на носителе (В,<С[Ат]0) может приводить к трудности его детекции, осуществляемой с помощью меченых антивидовых антител, что лимитируется чувствительностью регистрации метки.
• При некоторых значениях К выполнение условия В,^[Ат]0/2 может достигаться изменением начальной концентрации иммобилизованного антигена или антител.
Неоптимальный выбор концентрации антигена на носителе может привести к тому, что антитела практически полностью будут связываться с ним в отсутствие определяемого антигена. В этом случае снижение концентрации иммобилизованного антигена будет существенно влиять на чувствительность анализа. Теоретически (см. уравнение (9.43)] снижение за счет этого В,- с 0,99 [Ат]0 до 0,9[Ат]о не должно приводить к заметному изменению амплитуды калибровочной кривой, но предел обнаружения антигена может снизиться в 10 раз, благодаря изменению отношения [Ат]0/[Ат]р со 100 до 10 (рис. 48):
Степень связывания антител можно оценить экспериментально, сравнивая регистрируемый сигнал, получаемый при измерении иммобилизованного комплекса антиген — антитело после однократной инкубации и вторичного инкубирования раствора с несвязав-шимися антителами с новой дозой иммуносорбента. Если степень связывания велика, то регистрируемый сигнал во втором случае будет значительно меньше, чем в первом, что свидетельствует о необходимости снижения концентрации иммобилизованного антигена.
• Максимальная чувствительность в данной схеме достигается при проведении первой стадии в равновесном режиме. Но значительно на чувствительность влияет лишь степень приближения к равновесному состоянию реакции определяемого антигена с антителами. Так как эта реакция проходит в растворе, то скорость приближения ее к равновесию может быть значительно выше, чем процесса образования комплекса на носителе. В этом случае для сокращения времени анализа в целом целесообразно увеличивать концентрацию иммобилизованного антигена и проводить реакцию образования комплекса на твердой фазе в кинетическом режиме. Увеличение концентрации иммобилизованного антигена необходимо для образования комплекса в достаточном количестве для последующего его выявления мечеными антителами. Но при этом также следует соблюдать соотношение В,^|Ат]0/2, чтобы не допускать значительного влияния иммобилизованного компонента на реакцию антител с определяемым антигеном в растворе.
Быстрое разделение компонентов возможно в одной из модификаций данной схемы с использованием меченых специфических антител, что устраняет необходимость второй стадии и приводит к значительному сокращению длительности анализа в целом. Однако следует иметь в виду, что эффективное увеличение концентрации антигена на твердой фазе возможно не во всех случаях. Например, при использовании в качестве носителя широко распространенных планшетов и пробирок из непористого полистиро-
ла возможность увеличения концентрации лимитируется площадью поверхности материала.
