Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 100

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 123 >> Следующая

dt
d (АтАт*] = f. [Д [Ar*j _ ?*_itATAr*j (9 26)
dt
[Ат]0=[АтАг*]-|-[АтАг]-}-[Ат] (9.27)
ЛГ=[Аг] + [АтАг] (9.28)
[Аг*10=[Аг*] + [АтАг*1 (9.29)
с начальными условиями; [АтАг*]=0; {АтАг]=7У, где N — молярная концентрация антигена, оставшегося в комплексе с антитела-
ми после удаления несвязавшихся компонентов.
Возможности аналитической системы на второй стадии в основном определяются временем инкубации и концентрацией меченого
240
антигена. Как и для первой стадии, проведем качественную оценку влияния этих параметров.
Время инкубации. Скорость связывания в каждый момент времени пропорциональна концентрации свободных центров связывания антител. Поэтому наилучшее соответствие кривой титрования и калибровочной кривой (т. е. соблюдение условия строгой пропорциональности между концентрациями связанного меченого антигена и свободных центров связывания) должно достигаться при
Рис. 40. Теоретические кривые титрования (/) и калибровочные графики (2), полученные при временах проведения второй стадии ИФА по методу последовательного насыщения *=10 мин (а) и t=2 ч (б):
[Ат]0=0,2 нМ, [Аг*]0=1 нМ; *,-**,=-5 ¦ 10-5 М-1 ¦ с-1; А1 = ?*_1 = 10-'1 с-1
крайне малом времени проведения реакции. При возрастании времени инкубации пропорциональность может существенно ухудшаться прежде всего за счет диссоциации образовавшегося на первой стадии специфического комплекса. С наибольшей силой этот эффект должен проявляться в правой части калибровочного графика, где на первой стадии достигается значительное заполнение центров связывания. Образование свободных центров связывания вследствие диссоциации в концентрации &_i^[At]o (в линейном приближении) должно приводить к сдвигу правой части калибровочного трафика вверх относительно кривой титрования за счет связывания меченого антигена с освободившимися центрами. Для нивелирования этого эффекта достаточно, чтобы количество образующихся таким образом свободных центров связывания не превышало величину порядка 10% от [Ат]о, для чего время прове-
дения второй стадии следует выдерживать примерно На рис. 40 приведена графическая иллюстрация этого положения. Из рисунка следует, что при правильном выборе длительности инкубации с меченым антигеном калибровочный график и кривая титрования в нормированных координатах практически совпадают.
а Шв,нИ 5 1А%нМ
Рис. 41. Экспериментальные (а) и теоретические (б) калибровочные графики определения инсулина:
время инкубации с меченым антигеном для кривых / — 4 соответственно равно 5, 10, 20, 80 мин; теоретические кривые построены прн следующих значениях: [Ат]0=0,3 нМ; [Аг*)0= 1 нМ; ^=?*^=5*105 М-1 «с-i;
= !И с“1
На рис. 41 приведены теоретические и экспериментальные калибровочные графики определения инсулина, полученные при различных временах инкубации с меченым антигеном. Из сравнения теоретических кривых, полученных при значении &_i = 10~4 с-1 (0,1/'&_1»17 мин), следует, что при увеличении времени проведения второй стадии существенно выше 15 мин (кривые 3, 4) отношение между значениями ординат, соответствующими минимальной и максимальной концентрациям определяемого антигена, стремится к единице, что делает невозможным проведение анализа. Экспериментальные зависимости удовлетворительно коррелируют с теоретическими, что дает основание использовать расчетные данные для оптимизации реальной аналитической системы.
Концентрация меченого антигена. Практическим критерием выбора концентрации меченого антигена является возможность до-
стбверной регистрации сигнала от метки, связавшейся с антителами. При выполнении этого условия концентрация [Аг*]р в методе последовательного насыщения не является строго ограниченной! Однако возможны случаи, когда выбор неоптимального зна-ченйя [Аг*]0 может существенно отражаться на результатах анализа. Допустим, что в опыте используются поликлональные антитела, молекулы которых обладают различным сродством к антигену (такие антитела могут быть экспериментально разделены на высоко- и низкоаффинную фракции, для которых известны концентрации и константы связывания).
Рис. 42. Теоретические калибровочные графики для гетерогенной популяции антител:
[Аг*]0 для кривых (о) и (б) соответственно равны 1 н 10 нМ; популяция антител с общей концентрацией [Ат]0=0,3 нМ считается состоящей на 30% из высокоаффннных связывающих
центров (А|=*1*— 10s М—¦•с-1; A_i=A*_t = 10—4 с-1) и на 70% из ннзкоаффрнных (Ai=
=Ai*=105 М-’-с-1; k_ 1—й*_1—10—* с-*); время *=10 мин
Если значения концентраций и констант связывания двух функций антител значительно отличаются, то возрастание [Аг*]0 может приводить к возрастанию фонового сигнала, что проявляется в сдвиге правой части калибровочного графика вверх по ординате. Это объясняется тем, что при достижении полного заполнения высокоаффинных центров связывания дальнейшее возрастание [Аг*]о ведет к увеличению связывания конъюгата только с низкоаффинной фракцией, дающей вклад в калибровочную кривую в виде практически не меняющегося в необходимом диапазоне концентраций [Аг]0 сигнала. Расчетные кривые приведены на рис. 42. Для получения теоретической иллюстрации этого эффекта в модель были введены соответствующие усложнения, позволяющие считать популяцию антител состоящей из двух фракций с различным сродством к антигену.
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed