Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
1. 0,01 М фосфатный буфер (pH 7,4) с 0,1 М NaCl (ФБ). Исходные растворы: а) 1 М К2НРО4Х ХЗН20 —228 г на 1 л Н20; б) 1 М КН2Р04— 136 г иа 1 л Н20.
К 40 мл раствора (а) добавляют 10 мл раствора (б) и 29 г NaCl, затем доводят объем до 5 л
дистиллированной водой.
2. ФБ, содержащий 0,05% детергента твин-20 (ТФБ).
В 5 л ФБ растворяют 2,5 г твии-20.
3. 0,01 М Na-карбонатный буфер (pH 9,6).
К 13 мл 0,2 М раствора Na2C03 добавить 50 мл
0,2 М раствора NaHC03 и довести объем до 4 л
дистиллированной водой.
4. 0,05 М фосфат-цитратный буфер, pH 5,0.
К 10,3 мл 0,2 М раствора Na2HPC>4-2H20 добавляют 9,7 мл 0,1 М раствора лимоииой кислоты и доводят объем до 1 л дистиллированной водой. (0,2 М раствор готовят растворением 35,61 г Na2HP04-2H20 в 1 л Н20, а 0,1 М раствор — растворением 21,01 г лимоииой кислоты в 1 л Н20)
5. 0,05 М трис-HCl буфер, pH 8,5.
К 6,05 г три-(оксиметил)-амииометаиа добав-
ляют 275 мл 0,J М раствора НС] и доводят объем до 1 л дистиллированной водой.
6. 0,05 М веронал-мединаловый буфер, pH 8,6.
2,19 г мединала растворяют в 300 мл дистиллированной воды, затем в этот же раствор добавляют 0,35 г веронала. После полного растворения доводят объем до 1 л дистиллированной водой.
Приготовление растворов субстратов для определения пероксидазной активности
1. Фотометрическое определение с 5-аминосали-циловой кислотой (5-АС). Готовят раствор концентрацией 0,8 мг/мл путем растворения 5-АС в горячей (70°С) дистиллированной воде. Затем охлаждают раствор и доводят pH до 6,0 1 М раствором КОН. 30%-иую перекись водорода разводят в 20 раз холодной дистиллированной водой. Полученный 0,5 М раствор используют в качестве запасного и хранят при +4°С в непрозрачной пластиковой посуде.
Перед измерением активности разводят 0,5 М Н202 в 34 раза холодной дистиллированной водой и смешивают с раствором 5-AQ в объемном соотношении 10:1.
2. Фотометрическое определение с о-фенилендиаминам. В 10 мл фосфат-ци-тратного буфера (pH 5,0) растворяют 4 мг о-феиилеидиамииа и добавляют 10 мкл раствора 30%-ной перекиси водорода.
3. Xемилюминесцентное определение с люминалом. 9 мг люминола растворяют в 0,5 мл 0,2 М раствора NaOH и доводят объем до 10 мл 0,05 М трис-НС1 буфером (pH 8,5). 9 мг л-йодфеиола растворяют в 0,5 мл 0,2 М раствора NaOH и доводят объем до 10 мл трис-HCl буфером.
Исходный 30%-ный раствор Н202 разбавляют в 1000 раз дистиллированной ьодой (оптическая плотность при Х=230 им полученного 0,01 М раствора должна быть 0,74). Для приготовления 10 мл субстратной смеси к 9,4 мл 0,05 М трис-HCl буфера (pH 8,5) добавляют по 200 мкл каждого раствора. Субстратная смесь может храниться сутки при 4°С.
§ 2. Определение антител против вируса гриппа А у людей, вакцинированных гриппозной вакциной с
Зиаиие уровня антител против вируса гриппа дает возможность контролировать качество противогриппозных вакцин, оценивать эффективность вакцинации против гриппа и, в ряде случаев, может служить диагностическим критерием заболевания. Основные результаты, положенные в основу данных методических рекомендаций, приведены в работах, посвященных разработке иммуиофермеитного метода определения антител против вируса гриппа А (Н. В. Бабикова и др., 1984; Т. Ю. Стерикова и др., 1986).
В основу метода положена наиболее распространенная схема определения антител, включающая адсорбцию вируса гриппа в лунках-полистирольиых планшетов, последовательную инкубацию иммобилизованного вируса с исследуемой сывороткой крови (или другим препаратом, содержащим антитела) и с меченными пероксидазой антителами против иммуноглобулинов человека и определение активности фермента в образовавшемся специфическом комплексе на носителе,
Реагенты, материалы и оборудование, необходимые для проведения анализа *
Очищенный препарат вируса гриппа А, конъюгат
антител против иммуноглобулинов человека с пероксидазой (АТ-ПХ), компоненты для приготовления субстратной смеси на основе 5-АС (см. § 1 этой главы), полистирольные планшеты для ИФА, автоматические пипетки, спектрофотометр.
Выделение специфических антител против IgG человека
1. Специфические антитела против IgG человека выделяют методом аффинной хроматографии на колонке с иммуносорбентом (бромциан сефароза с иммобилизованным IgG человека).
¦ 2. Колонку (IXЮ см) заполняют иммуносорбентом, промывают 100 мл
0,1 М фосфатного буфера, pH 7,4, с 0,1 М NaCl (ФБ).
3. Вскрывают 3 ампулы коммерческой моноспецифической сыворотки, содержащей антитела к IgG-человска, растворяют содержимое каждой ампулы в 1 мл дистиллированной воды, растворы объединяют и наносят на колонку с иммуносорбентом. Раствор пропускают через иммуносорбент со скоростью ~ 1 капля в 10 с.
