Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Время проведения анализа по конкурентной схеме определяется, в основном, временем приближения реакции антиген — антитело к равновесному состоянию. Это время, в свою очередь, зависит от констант скоростей реакции образования и диссоциации комплекса антиген — антитело, а также от начальных концентраций компонентов. Так как значения констант скоростей Ki и /С-i обусловлены природой реагирующих веществ, диапазон концентрации определяемого антигена — его содержанием в исследуемой пробе, а меченого — чувствительностью метода регистрации ферментативной активности, время достижения равновесия практически можно снижать только увеличением концентрации антител *. В связи с этим при проведении конкурентного анализа уменьшение времени инкубации компонентов за счет увеличения концентрации антител возможно лишь в тех случаях, когда концентрация антигена в растворе значительно превосходит нижний предел чувствительности метода, определенный при оптимальной концентрации антител.
При условии равенства констант скоростей образования и диссоциации специфического комплекса для определяемого и меченного ферментом антигена время достижения равновесного состояния в реакции с антителами одинаково. Текущая и равновесная концентрации меченого компонента в данном случае могут быть
Рис. 38. Теоретические кинетические кривые изменения концентрации компонентов при конкурентном аиалнзе:
[Ат]о=50 нМ; [Аг]о=30 нМ; [Ат*]о= =4,4 нМ; k, = *,*-10* М-'-с-1; ?_,= =ft*_, = 5- 10-5 с-1
* Следует учитывать, что увеличение концентрации антител можно проводить лишь до определенного предела, чтобы антитела находились в недостатке по отношению к концентрации аитигеиа и имели место конкуренции свободного и меченого аитнтела за связывание с активными центрами антител.
определены с учетом начального мольного соотношения антигенов в реакционной смеси. Эти положения иллюстрируются теоретическими кинетическими кривыми изменения концентрации компонентов при конкурентном анализе (рис. 38).
§ 2. Метод последовательного насыщения
В отличие от конкурентного ИФА рассматриваемый метод основан на последовательном взаимодействии антител сначала с определяемым, а затем с меченным ферментом антигеном. Проведение анализа возможно двумя путями. В первом случае меченый антиген добавляется непосредственно в инкубационную смесь, содержащую антитела и исследуемый образец. Во втором случае (возможном только при применении твердофазного ИФА) иммуносорбент после первой реакции отмывают от несвязавшихся компонентов, а затем вводят меченый антиген. В методическом плане второй путь часто предпочтительней, так как позволяет избежать возможное ингибирующее влияние компонентов исследуемой биологической жидкости на фермент-маркер (см. гл. 4, § 2).
Концентрация связавшегося с антителами конъюгата пропорциональна начальной концентрации антигена и служит характеристикой его содержания в исследуемом образце.
• Проведем рассмотрение схемы, исходя из следующих условий:
1) комплекс антиген — антитело образуется в стехиометрическом соотношении 1:1; возможность образования комплексов более сложного состава не учитывается;
2) реакция антител с антигеном на первой стадии проходит до установления равновесия;
3) антитела взаимодействуют с определяемым и меченым антигенами с разными константами связывания;
4) в ходе анализа регистрируется концентрация меченого антигена, связавшегося с антителами;
5) перед добавлением меченого антигена комплекс антитело — антиген отделяется от несвязавшихся компонентов;
6) в процессе инкубации с меченым антигеном связавшийся на первой стадии определяемый антиген способен диссоциировать из комплекса с антителами.
Модель, основанная на этих допущениях, не отражает всей сложности реальной системы, но дает возможность оценить влияние наиболее существенных параметров на результаты анализа.
Анализ метода последовательного насыщения упрощается, если рассматривать две его стадии раздельно. На первой стадии фактически происходит титрование антител антигеном и количество свободных центров связывания антител уменьшается с увеличе-
нием начальной концентрации антигена. Этот процесс описывается зависимостью [АтСвободные]=/([Аг]0) и является определяющим для анализа в целом.
Как и в рассмотренном конкурентном ИФА, при возможности прямого определения свободных антител . (или образовавшихся комплексов антиген — антитело) анализ мог бы быть ограничен одной стадией. Необходимость во второй стадии возникает только из-за отсутствия методов регистрации первого процесса в области низких концентраций антигена. В связи с этим во второй стадии появляется возможность регистрировать информацию, заложенную в систему на первой стадии, а именно концентрацию оставшихся свободными центров связывания антител. Следовательно, задача оптимизации условий проведения второй стадии состоит в передаче этой информации с минимальными искажениями, что достигается при наличии линейной пропорциональности регистрируемого сигнала количеству оставшихся свободными активных центров антител. Тогда, базируясь на той же логике рассуждений, что и для конкурентного анализа, можно заключить, что задачей оптимизации метода последовательного насыщения в целом является выбор условий, приводящих к максимальному соответствию результирующей калибровочной кривой и кривой титрования, получаемой на первой стадии.
