Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 113

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 123 >> Следующая

Для работы используют ПХ с RZ(Aio3/A2so) =
=2,9-^3,3.
1. Получение конъюгата Ат-ПХ осуществляют перйодатным синтезом по методике, описанной в гл. 8, § 2.
2. Конъюгат выделяют гельхроматографией иа колонке (1,6X100) см с сефадексом G-200, уравновешенным ФБ, при температуре +4°С. Скорость элюции
0,2—0,3 мл/мии. Измеряют оптическую плотность собранных фракций (по 3 мл) на спектрофотометре при длинах 280 нм и 403 им. Объединяют фракции конъюгата, имеющие значение коэффициента связывания (^(= Л403/Л280) от 0,4 до 0,6; при Л4оз определяют концентрацию по ПХ, разливают небольшими порциями и хранят при —20°С,
Адсорбция иммуноглобулинов
на нерастворимом носителе
1. В качестве твердой фазы используют полисти-рольные планшеты, в лунки которых вносят по 0,2 мл раствора 1 gG-фракции, разведенной ФБ до конечной концентрации 20 мкг/мл. Инкубируют в течение ночи при 4°С и отмывают ТФБ.
2. Планшеты сушат на воздухе и хранят при —20°С в герметически закрытых пакетах с осушителем.
Постановка иммуноферментного анализа
для определения HBsAg
1. В лунки планшетов с адсорбированными антителами вносят по 0,2 мл исследуемой сыворотки или плазмы и инкубируют 2 ч цри 37°С. После завершения инкубации отмывают пробы пять раз ТФБ.
2. В лунки вносят по 0,2 мл раствора конъюгата в ТФБ с концентрацией по ПХ И мкг/мл, содержащего 1 % нормальной сыворотки крови человека. Инкубируют 2 ч при 37°С. Затем отмывают пять раз ТФБ.
3. Вносят в лунки по 0,1 мл раствора субстратной смеси иа основе о-феии-лендиамина (см. § .1 этой главы) и инкубируют 40 мин в темноте при комнатной температуре.
4. После инкубации останавливают ферментативную реакцию добавлением 50 мкл 2 N H2SO4 в каждую луику и измеряют оптическую плотность проб'на спектрофотометре при А,=492 нм.
5. К каждому опыту ставится положительный контроль в трех повторах и отрицательный — в семи. Положительным контролем является сыворотка или плазма человека, содержащая стандартное количество HBsAg. Отрицательным контролем является сыворотка или плазма человека, не содержащая HBsAg и антител против HBsAg.
Интерпретация результатов
1. Определяют средние значения оптической плотности положительных и отрицательных проб. Отношение этих величии должно Превышать 10, в противном случае результаты ие считаются значимыми.
2. Содержание HBsAg в исследуемых пробах определяется по отношению оптической плотности этих проб к среднему значению оптической плотности отрицательных контролей, умноженной на 2,1. Если оптическая плотность исследуемого образца выше этого значения, то он считается положительным на содержание HBsAg, если ниже — то отрицательным.
3. Пример. Среднее значение оптической плотности отрицательных контролей: Лк=0,075. Нижняя граница положительных результатов: ЛКХ2,1 =0,158, Оптическая плотность исследуемых проб:
0,165
0,568
0,093
0,107
4. Все положительные результаты должны быть подтверждены нейтрализацией. Для этого раствор конъюгата делят иа две части и добавляют к одной сыворотку, содержащую антитела к HBsAg в высоком титре, а в другую — соответствующую нормальную сыворотку в той же коицеитрации. После параллельной инкубации двух проб положительного по предварительным данным об-
Содержание
HBsAg
+
+
разца вносят в одну из них конъюгат с нейтрализующей (иммунной) сывороткой, а в другую — с нормальной.
Далее проводят анализ как описано выше.
Если оптическая плотность пробы с нейтрализующей сывороткой в два раза и более ниже, чем с нормальной, то наличие HBsAg в данном образце считается доказанным.
При постановке реакции нейтрализации ставится три положительных и семь отрицательных коитролей (те же, что и в обычиой реакции). Оптическая плотность стандартных положительных проб после инкубации с конъюгатом, содержащим нейтрализующую сыворотку, должна быть в два раза и более ниже, чем с нормальной сывороткой, и приближаться к уровню отрицательных конт-ролей. Оптическая плотность отрицательных стандартных проб с нейтрализующей и иормальиой сывороткой ие должна статистически различаться. В противном случае нейтрализация считается иеспецифической, а результаты — недостоверными,
§ 4. Определение ротавируса и специфических антител
Заболевания молодняка крупного рогатого скота (к.р.с.), вызываемые ротавирусом, наносят значительный ущерб животноводству. Одной из мер борьбы является диагностика заболевания на ранних стадиях, для чего необходимы высокочувствительные методы детекции вируса.
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed