Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
(30°С). Выращивайте клетки при 30°С до Абоо = 0,3.
6. Проведите индукцию обеих культур, инкубируя их в течение 15 мин при
42-43°С.
7. Инкубируйте 3 ч при 37°С.
8. Проверьте индукцию, отобрав из каждой культуры пробы по 1 мл. Добавьте
в эти пробы по капле СНСЬ, инкубируйте в течение 5 мин при 37°С. Культура
в пробе должна лизировать.
9. Слейте вместе обе эти культуры объемом по 200 мл. Осадите клетки,
центрифугируя в течение 10 мин при 5000 об/мин.
10. Ресуспендируйте в 40 мл холодного буфера для разведения фага X.
Отцентрифугируйте 10 мин при 5000 об/мин.
16. Трансфекция ДНК фага %
99
И. Ресуспендируйте в 10 мл буфера для упаковки:
0,04 М трис (pH 8),
0,01 М MgS04,
0,01 М спермидин-ЗНС1,
0,01 М путресцин-2НС1,
0,1% р-меркаптоэтанол 7% ДМСО.
12. Центрифугируйте 5 мин при 5000 об/мин.
13. Ресуспендируйте осадок в 1 мл буфера для упаковки. Разлейте объемами
по 20 мкл в полипропиленовые центрифужные пробирки на 0,5 мл.
14. Заморозьте в жидком азоте и храните при -70°С. Можно хранить
несколько месяцев.
Литература
Hohn В., Murray К-, 1977. Packaging recombinant DNA molecules into
bacteriophage particles in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 3259.
Sternberg N., Tiemeier D., Enquist L., 1977. In vitro packaging of a XDim
vector containing ?eoRI DMA fragments of E. coli and phage PI, Gene, 1,
255.
Методика 16
Трансфекция ДНК фага X
I. Выращивание клеток
1. Отдельной колонией с чашки засейте 10 мл бульона LB в колбе на 125 мл.
Инкубируйте в течение 20 ч при 37°С.
2. Разведите эту бактериальную культуру 1 : 100 в бульоне LB. На одну
трансфекцию используйте 5 мл бульона (обычно засевают 50 мл бульона в
колбе на 500 мл). Инкубируйте на качалке при 37°С, пока культура не
достигнет плотности, при которой Абоо = 0,6-0,7. На это уходит обычно 2-3
ч. При А6оо - 0,3 добавьте тимидин до концентрации 50 мкг/мл.
II. Приготовление клеток
1. Осадите клетки, центрифугируя 5 мин при 5000 об/мин при 2°С.
100
Раздел II. Методики
2. Ресуспендируйте в половинном объеме среды СТ (50 мМ СаС12 и 50 мкг/мл
тимидина). Все растворы, пробирки и пипетки должны находиться при 0°С (в
ледяной бане).
3. Инкубируйте 5 мин при 0°С (в ледяной бане).
4. Осадите клетки, центрифугируя 5 мин при 5000 об/мин и2°С.
5. Ресуспендируйте в '/го исходного объема среды СТ при 0°С.
III. Заражение клеток ДНК
1. Добавьте 0,2 мл клеток к 0,1 мл ДНК (максимально 100 нг) в 0,1 М трис
с pH 7,2 (0,09 М трис-HCl и 0,01 М трис-осно-вание) и 50 мкг/мл тимидина
при 0°С (в тонкостенной стеклянной пробирке при 0°С).
2. Инкубируйте в течение 3-60 мин при 0°С; 2 мин при 45°С. Высейте клетки
в 2,5 мл мягкого агара LB на чашки, находящиеся при комнатной
температуре.
3. Эффективность должна составлять около 2-103 бляшек на 1 нг ДНК фага Я,
или примерно 1 бляшка на 104 молекул.
IV. Хранение клеток
1. Обработанные Са2+ клетки можно заморозить в среде СТ с 7%
диметйлсульфоксида, погружая рх в жидкий азот. Аликвоты по 1 мл хранят в
жидком азоте.,
2. Клетки размораживают при 0°С. После этого следуйте описанной выше
методике, начиная с этапа III-1.
3. Клетки можно также ресуспендировать в 0,01 М MgS04, как на этапе II-2,
и хранить около недели при 4°С. Эффективность трансфекции ДНК фага % при
этом обычно снижается в 2-10 раз.
Обсуждение
I. По-видимому, на эффективность трансфекции влияет история культуры.
Поэтому всегда выращивайте сначала ночную культуру, а затем разводите ее
в 100 раз и подращивайте. Не следует выращивать культуру до плотности,
большей чем Абоо = 0,7. Если культура переросла, то начните выращивать
новую культуру, разведенную в 100 раз. Важное значение имеет хорошая
аэрация, и поэтому выращивайте культуру в большой колбе. При
использовании некоторых штаммов бактерий добавление тимидина повышает
эффективность трансформации в два - четыре раза.
II. Для получения высокой эффективности трансформации важно строго
выдерживать культуру на холоду (при 0°С). Клетки нельзя нагревать даже на
короткое время.
17. Субклонироваше фрагментов ДНК в плазмидах Е. coli
101
III. При использовании более 100 нг ДНК на трансфекцию общее число
бляшек, образующихся на чашке, может снизиться. Тонкостенной стеклянной
(не пластиковой) пробиркой пользуются для того, чтобы получился более
быстрый температурный шок. В случае фага К, но не в случае плазмид очень
важно, чтобы нагрев до 45°С происходил быстро. Ожидаемая эффективность
составляет 2-103 бляшек на 1 нг, но это - максимальное значение.
IV. Если используются замороженные клетки, то эффективность
трансфекции ДНК фага К обычно снижается в 2-10 раз. С успехом могут
использоваться клетки, хранившиеся _за-мороженными в течение 9 мес.
Клетки
¦SF8 (Е. coli) hsdR- hsdM~ recB recC lop-11 (суперпродуцент лигазы)
supE44 (su2+) gal-96 SmR leuB6 thi-l (Bl~) thr~
HB101 (E. coli) hsdR- hsdM~ гесАХЪ supE44 (su2+) lacZ4 leuB6 proA2 thi-l
(Bl~) SmR
BNN45 (E. coli) hsdR- hsdM+ recA supE44 (su2+) supF (s"3+) Bl~ met~
Литература
