Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
(pH 7,5), 1 мМ Ыаз-ЭДТА и 50 мкл 5 М ацетата калия. Если при этом
образовался преципитат, то отцентрифугируйте его и перенесите
надосадочную жидкость в новую пробирку. До-
12. Выделение плазмидной и бактериальной ДНК
93
бавьте 0,5 мл этанола и поместите на 20 мин в лед. Так как РНК уже
удалена из препарата, то ДНК предипитирует хуже. Повторите этапы 11, 12 и
13.
И.Б. Быстрый метод выделения плазмидной ДНК из 10 мл жидкой культуры
1. Вырастите клетки до насыщения в 10 мл бульона LB с 0,4% глюкозы. Если
необходимо, то добавьте используемый для отбора лекарственный препарат.
2. Отцентрифугируйте клетки прямо в той пробирке, в которой выращивали
культуру, или в центрифужной пробирке на 10 мл. Ресуспендируйте осадок в
1,4 мл 10 мМ трис (pH 8,5) и 1 мМ На3-ЭДТА.
3. Перенесите суспензию клеток в пробирку от микрофуги на
1,5 мл и центрифугируйте в течение 30 с.
4. Ресуспендируйте в 0,4 мл раствора, содержащего 15% сахарозы, 50 мМ
трис-HCl и 50 мМ Ыаг-ЭДТА' (pH 8,5). Тщательно перемешайте в смесителе
Vortex.
5. Поместите в лед и добавьте 0,1 мл свежеприготовленного раствора
лизоцима с концентрацией 5 мг/мл в приведенном выше буфере при 0°С.
6. В течение 10 мин держите во льду, периодически осторожно переворачивая
пробирку.
7. Добавьте 0,3 мл раствора, содержащего 0,1% тритона Х-100, 50 мМ трис-
HCl и 50 мМ Ыаг-ЭДТА (pH 8,5) при 0°С.
8. В течение 10 мин держите пробирку во льду, периодически осторожно
переворачивая.
9. Центрифугируйте в течение 2 мин в микрофуге, помещенной в холодную
комнату.
10. Слейте надосадочную жидкость в новую пробирку от микро-фуги.
11. Добавьте 2 мкл диэтилоксидиформат а, перетрясите.
12. Прогрейте в течение 15 мин при 70°С, 15 мин подержите во льду, после
чего центрифугируйте в' течение 2 мин в микро-фуге.
13. Слейте надосадочную жидкость в новую пробирку от микрофуги.
14. Долейте пробирку доверху этанолом при комнатной температуре.
15. Осадите преципитат, центрифугируя 5 мин в микрофуге.
16. Слейте надосадочную жидкость. Пробирку переверните на бумажное
полотенце, чтобы дать жидкости стечь. Вся жидкость должна стечь. Ее можно
выпарить, но нельзя пересушить осадок.
17. Растворите осадок ДНК в 50 мкл раствора:
10 мМ трис (pH 7,5),
94
Раздел П. Методики
1 мМ Nas-ЭДТА,
10 мкг РНКазы А.
На полосу агарозного геля достаточно наносить 5 мкл такого препарата.
Полученная таким способом ДНК расщепляется большинством ферментов
рестрикции.
Методика 13
Удаление бромистого этидия из ДНК, находящейся в растворе CsCl
Экстракция изопропанолом или бутанолом
1. Добавьте 1 объем ДНК в растворе CsCl, плотность которого равна
плавучей плотности ДНК, и бромистый этидий в пробирку, вмещающую по
меньшей мере 10 таких объемов. Пробирку нужно взять такую, чтобы ее можно
было герметически закупорить и центрифугировать (можно использовать
полипропиленовые или стеклянные пробирки, но ни в коем случае не пробирки
из поликарбоната).
2. Добавьте 1 объем изопроианола или бутанола, насыщенного водным
раствором, содержащим 5 М NaCl, 10 мМ трис и 1 мМ Nas-ЭДТА (pH 8,5).
3. Герметично закройте пробирку и перемешайте содержимое. Это нужно
проделывать в перчатках.
4. Повторяйте экстракцию до тех пор, пока полностью не исчезнет видимая
окраска. После этого экстрагируйте еще один раз. Чем выше концентрация
ДНК, тем больше требуется проводить экстракций.
5. Добавьте 2 объема НгО.
6. Добавьте 6 объемов этанола и оставьте при -20°С на время от 1 ч до
Нескольких дней.
7. Отцентрифугируйте осадок.
8. Промойте осадок 70%-ным этанолом.
9. Слейте надосадочную жидкость и высушите осадок.
10. Растворите осадок в 100 мкл 10 мМ трис и 1 мМ Nas-ЭДТА (pH 7,5).
Обсуждение
1. Бромистый этидий является мутагеном (30 мкг бромистого этидия
обладают таким же мутагенным действием, как дым
14. Образование гибридных фагов 7gt
95
от одной сигареты). Пользуйтесь пробиркой, из которой не вытекают
жидкости с низким поверхностным натяжением.
2. Насыщение спирта раствором с высокой концентрацией соли улучшает
разделение фаз и приводит к тому, что вода не утягивается из водной фазы.
3. (Этапы 3 и 4); разделение бромистого этидия между такими двумя фазами
происходит быстро, и для этого не нужно интенсивного встряхивания.
4. (Этап 5); воду добавляют для того, чтобы при добавлении этанола CsCl
не выпадал в осадок.
5. (Этап 6); в присутствии этанола большие количества ДНК (50 мкг) легко
выпадают в осадок, и при этом не требуется сильного охлаждения. Однако,
так как ДНК очень чистая, длительное осаждение не приводит к загрязнению
препарата.
Методика 14
Образование гибридных фагов Xgt
I. Расщепление ДНК
1. Расщепите по отдельности ДНК вектора и встраиваемую ДНК- Если
использовать примерно по 5 мкг каждой из этих ДНК, то при трансфекции
должно получиться около 5-104 гибридов.
ДНК в буфере: ДИК 50 мкг/мл или больше,
буфер для рестрикции с низким, средним или высоким содержанием соли (см.
приложение 7), 10~4 М Na2-ЭДТА.
2. Добавьте Via объема 0,1 М MgS04, чтобы получить 0,01 М MgSO*.
