Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
поддерживать с помощью селекции.
1.В качестве помощника предлагается Xgt4-lacb. Этот фаг несет мутантный
ген репрессора А,с1857 и содержит ген р-га-лактозидазы Е. coli (lacZ).
При получении препарата фага на чашках используют такие клетки-хозяева,
которые не могут расти на минимальных средах. Это делается для того,
чтобы исключить возможность загрязнения препаратов фага клетками,
способными расти на селективных чашках.
19. Комплементация гибридного фага в клетках Е. coli
107
2. Клетки выращивают на минимальной среде, чтобы они к ней
адаптировались. Мальтозу добавляют для лучшей адсорбции фага К.
3. Если перед центрифугированием плотность культуры была значительно
ниже, чем 109 клетка/мл, то клетки можно ре-суспендировать в меньшем
объеме, но так, чтобы получилась плотность около 1010 клетка/мл.
4. При таком соотношении клеток и фага большинство клеток будет заражено
несколькими фагами-помощниками, но небольшая часть клеток будет заражена
более чем одним гибридным фагом. Заметьте, что на чашки высевают по многу
клеток. Если частота реверсий используемой мутации составляет 10-7, то из
колоний, выросших на минимальных чашках, несколько колоний окажется
ревертантами. Эти ревер-танты, наверное, содержат интегрированный фаг-
помощник и могут содержать какой-то случайный гибрид фага %. Поэтому
важно проводить повторный тест на комплементацию.
5. Инкубирование клеток и фага в высоких концентрациях обеспечивает
хорошую адсорбцию.
6. Мягкий агар приготавливается на воде. Его можно расплавить
непосредственно перед использованием, а минимальные среды добавить после
того, как он охладится до 50°С.
7. Большинство фагов - помощников интеграции несет
температурочувствительную мутацию по репрессору с1857. Поэтому
температуру никогда нельзя поднимать выше 37°С. Использование мутации
с1857 помогает выделять гибрид на этапе 10.
8. Контрольные чашки необходимы, поскольку они позволяют быстро оценить
возможность комплементации. Высевая клетки без фага, определяют
количество ревертантов в препарате клеток. В разных препаратах может
содержаться разное количество ревертантов. Высевая фаг без клеток,
определяют содержание в препарате фага клеток, способных расти на
минимальных чашках. Высев различных количеств гибридного фага позволяет
быстро выявить наличие комплементации, так как число истинных
комплементаций должно быть пропорционально количеству гибридного фага.
Обычно пул гибридов из Salmonella дает около 10 комплементирую-щих
колоний на чашку.
9. (Этапы 9 и 10); при инкубации суспензии клеток при 42°С происходит
индукция лизогенных бактерий (если они несут мутацию с1857). Через 20 мин
инкубации индукция становится необратимой.
10. (Этапы 11 и 12); фаг - помощник интеграции несет область lac и на
чашках с Xgal образует голубые бляшки. Бесцветные бляшки образуют
гибридные фаги, которые могли отвечать за рост клеток.
108
Раздел II. Методики
11. (Этап 13); повторить комплементацию необходимо для того, чтобы
подтвердить обнаруженный эффект.
Литература
Struhl К., Cameron J. R" Davis R. W., 1976. Functional genetic expression
of eukaryotic DNA in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci., 73, 1471.
Электрофорез в агарозном геле проводят в горизонтальном направлении, так
как при этом 1) гель с низкой концентрацией агарозы лучше держится, 2)
получается меньшее перекашивание (коллапс) в процессе электрофореза и 3)
меньше искажаются полосы ДНК. По-видимому, проще всего работать с
системой, когда гель полностью покрыт слоем буфера для электрофореза
толщиной около 1 мм. Сопротивление агарозы ненамного превышает
сопротивление буфера, так что значительная часть тока течет через
агарозу.
А. Буферы
Во все буферы с нейтральными значениями pH можно добавлять 0,5 мкг/мл
бромистого этидия.
1. Трис-боратный буфер 10Х (на 1л)
89 мМ трис-основание 108 г
Методика 20
Электрофорез в агарозном геле
I. Агарозный гель
89 мМ борная кислота
2,5 мМ На2-ЭДТА pH 8,3
55 г 9,3 г
2. Трис-фосфатный буфер
10Х (на 1 л)
89 мМ трис-основание 23 мМ Н3Р04
108 г
15,5 мл 85%-ного раствора Н3РО4 (1,679 г/мл)
2,5 мМ Na2-3flTA pH 8,3
9,3 г
3. Трис-ацетатный буфер
40 мМ трис-основание 20 мМ уксусная кислота
50 X (на 1 л) 242 г
57,1 мл ледяной уксусной кислоты
2 мМ Ыа2ЭДТА pH 8,1
37,2 г
20. Электрофорез в агарозном геле
109
4. Щелочной буфер 30 мМ NaOH 2 мМ Ыаа-ЭДТА
100х (на 1 л)
166 мл 50%-ного NaOH
74,5 г
В процессе электрофореза буфер у анода защелачивается, а у катода
закисляется. Поэтому обычно пользуются буферной системой с высокой
емкостью. Буферы не содержат ионов СИ, ¦так как последние не обладают
буферной емкостью, и их присутствие может привести к тому, что ДНК в геле
утратит биологическую активность.
1. Трис-боратный буфер. Обладает высокой буферной емкостью. При его
использовании, по-видимому, получаются наиболее узкие полосы. Основной
раствор ЮХне зарастает, но при длительном хранении в нем образуется
осадок, который растворим в щелочи. В присутствии бората агарозные гели
