Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
фага выпрыскивается через хвостовой отросток.
А. 1. 1\1а2-ЭДТА добавляют для того, чтобы хелатировать ионы Mg2+.
2. Выпрыскивание ДНК происходит, очевидно, очень быстро. Однако
длительный контакт с формамидом, по-видимому, не оказывает на ДНК
повреждающего действия.
3. Воду добавляют для того, чтобы CsCl не выпал в осадок после добавления
этанола.
4. (Этапы 4 и 5); ДНК быстро образует преципитат, и обычно для этого не
требуется охлаждать раствор. Если центрифугирование не будет таким
кратковременным, то ДНК трудно будет ресуспендировать.
5. (Этап 6); осадок споласкивают, чтобы удалить остатки CsCl и формамида.
6. (Этапы 7 и 8); ДНК быстрее всего растворяется при очень низкой
концентрации соли. Однако при длительном хранении (в течение месяцев) ДНК
меньше деградирует при более высоких концентрациях соли и Ыа2-ЭДТА.
Б. Эта методика аналогична приведенной выше, но в данном случае
добавление и удаление формамида проводят с помощью диализа. При этом не
требуется осаждения этанолом. В формамиде могут содержаться примеси,
которые не удаляются при осаждении спиртом. Очевидно, все то, что в
процессе диализа может поступать внутрь мешка, может при последующем
диализе удаляться оттуда.
4**
84
Раздел II. Методики
Эта методика, по-видимому, лучше всего подходит для получения больших
количеств ДНК фага X, так как большой осадок ДНК после осаждения этанолом
может растворяться плохо.
II. Быстрый метод выделения ДНК фага X
1. Получите обычный препарат фага X на чашках, используя среды с
агарозой.
2. Охладите чашки. Налейте на них по 5 мл холодного буфера для разведения
фага X. Оставьте чашки на ночь при 4°С.
3. Пипеткой перенесите 0,4 мл осветленного лизата в пробирку на 1,5 мл от
микрофуги. Оставшийся лизат можно сохранить для целей культивирования.
4. Добавьте 1 мкл диэтилоксидифордоата при комнатной температуре.
5. Добавьте 10 мкл 10%-ного раствора ДСН (додецилсульфа-та натрия).
Перевернув пробирку, перемешайте содержимое.
6. Добавьте 50 мкл раствора 2 М трис и 0,2 М Ыа2-ЭДТА (pH 8,5).
Перемешайте.
7. Инкубируйте в течение 5 мин при 70°С, прикрыв сверху крышкой.
8. Добавьте 50 мкл 5 М ацетата калия.
9. Охладите пробирки и поместите их в лед, по крайней мере на 30 мин.
10. Осадите преципитат центрифугированием в микрофуге в течение 15 мин.
11. Надосадочную жидкость слейте в новую пробирку.
12. Заполните пробирку этанолом при комнатной температуре.
13. Отцентрифугируйте в микрофуге в течение 5 мин.
14. Слейте надосадочную жидкость. Переверните пробирку и поставьте ее на
бумажное полотенце, чтобы позволить жидкости стечь. Вся жидкость должна
либо стечь, либо ее нужно испарить, однако нельзя пересушить осадок.
15. Растворите осадок ДНК в 50 мкл раствора:
10 мМ трис (pH 7,5),
1 мМЫаз-ЭДТА,
10 мкг/мл РНКазы А.
16. Обычно достаточно 5 мкл на одну пробу по рестрикции и на одну дорожку
в геле.
Обсуждение
1. Неочищенный агар сильно ингибирует большинство рестрик-тирующих
эндонуклеаз и других ферментов, работающих на ДНК. Это ингибирующее
действие может быть обусловлено
11. Выделение ДНК из фага %
85
сульфонированными углеводородами. Выделяемая этим методом ДНК фага X
происходит как из частиц фага, так и из свободной, выделенной в среду
ДНК. После расщепления эндонуклеазой ДНК Е. coli распределяется при
электрофорезе по всей полоске гелия. Это позволяет увидеть лишь полосы
ДНК фага X, которых в молярном отношении оказывается больше.
2. При охлаждении чашек повышается твердость агарозы. Это предотвращает
суспендирование агарозы при наслаивании и сборе жидкости с чашек на
следующем этапе. Фаг и фаговая ДНК диффундируют из верхнего слоя агарозы
в наслоенную жидкость. При охлаждении чашек и использовании холодного
буфера для разведения фага X снижается также деградация ДНК после того,
как она диффундирует в наслоенную жидкость.
3. С агарозной чашки, как и с обычной чашки, получается 4 мл препарата
фага с титром 1010 частиц фага в 1 мл. В 0,4 мл такого препарата
содержится столько фага и фаговой ДНК, сколько нужно примерно на десять
полосок в геле.
4. Диэтилоксидиформат добавляют, чтобы инактивировать нук-леазы. На
начальных этапах нуклеазы, по-видимому, ингибируются агарозой, так как
при 37° С ДНК не деградирует до тех пор, пока ее вместе с наслоенной
жидкостью не снимут с чашки.
5. ДСН денатурирует белки и приводит к выделению ДНК из фаговых частиц.
6. Трис добавляют для того, чтобы забуферить раствор, так как
диэтилоксидиформат вызывает образование около 30 мМ С02. Ыаг-ЭДТА
добавляют, чтобы хелатировать ионы Mg2+ в буфере для разведения фага X.
7. Смесь нагревают до полной денатурации белка.
8. Добавление ацетата калия приводит к выпадению осадка денатурированных
белков с калиевой солью додецилсульфа-та. Ацетат калия добавляют перед
тем, как охладить пробирки, в результате чего преципитат образуется
медленнее и оказывается мельче. Такие преципитаты легче удалять с помощью
центрифугирования.
9. Охлаждение обеспечивает полноту преципитации.
