Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
день-два до проведения скрещивания.
5. (Этап 6); клетки разводят для того, чтобы обеспечить хорошую аэрацию
при последующем росте и чтобы предотвратить реадсорбцию после лизиса
клеток. Использование на этой стадии бульона LB (который не содержит
мальтозы) приводит к дополнительному подавлению реадсорбции потомства
фага X после лизиса.
6. (Этап 7); критериями успешного скрещивания служат выход фага (должен
быть выше 20), равная передача родительских маркеров и хорошая адсорбция
внесенного
фага. Обычно, чтобы получить частоты рекомбинации при скрещиваниях,
определяют все эти параметры. Если частоты рекомбинации низки, то важно
знать частоту ожидаемых ревертантов. Таким удобным контролем служит
заражение каждым из скрещиваемых фагов по отдельности.
II. 1. Тест на комплементацию в жидкой среде проводят почти так же, как
и скрещивания, за исключением того, что в качестве клеток-хозяев при этом
выступает непермиссив-ный штамм бактерий. Здесь также важно заражать
клетки равным количеством фагов (множественность заражения 5-10),
определять количество неадсорбированного фага и число клеток в момент
инфицирования, а также и выход фага, что в данном случае и составляет
цель эксперимента. Чтобы понизить фон неадсорбированного фага, часто
пользуются сывороткой против него. При комплементации в жидкой среде
очень важно ставить в качестве контроля заражение каждым из родительских
фагов по отдельности, а также определять частоту реком-
10. Тесты на рекомбинацию и комплементацию фага in vivo
81
GEDRNKEN EXPERIMENT
Для "мыслителей", которые не любят работать в лаборатории, мысленные
эксперименты (gedanken experiments) - это выход из положения. Некоторые
мысленные эксперименты приносят реальную пользу, а о некоторых лучше бы
забыть.
бинации при непермиссивных условиях, так как реверсии и рекомбинация
могут привести к неожиданно высоким выходам.
При комплементации важно, чтобы адсорбция и заражение проходили при
строго непермиссивных условиях. Например, при тесте на комплементацию
температурочувствительного мутанта и амбер-мутанта используют хозяина su~
и высокую температуру. Поэтому нужно внимательно следить за температурой,
при которой происходят адсорбция и рост. В качестве контроля необходимо
проводить заражение фагом дикого типа и заражение по отдельности каждым
использованным мутантом в тех же самых условиях.
2. Титровать следует на хозяине, пермиссивном для обоих родительских
фагов (например, на клетках su+ при 25°С
4-301
82
Раздел II. Методики
в случае комплементации между температурочувствительным мутантом и амбер-
щт&тои фага). Выводы основаны на сравнении выхода при совместном
заражении с выходом при заражении каждым мутантом по отдельности и с
выходом при заражении фагом дикого типа.
Методика И Выделение ДНК из фага X
I. Формамидный метод
А. 1. Смешайте 1 объем фага в растворе CsCl с плотностью, равной плавучей
плотности фага, 10 мМ MgS04, 10 мМ трис (pH 8), и 0,1 мМ Nag-ЭДТА с Vio
объема 2 М трис и 0,2 М Nag-ЭДТА (pH 8,5) в полипропиленовой пробирке от
микрофуги.
2. Добавьте 1 объем формамида и оставьте при комнатной температуре на
время от 30 мин до нескольких часов.
3. Добавьте 1 объем Н20.
4. Добавьте 6 объемов этанола при комнатной температуре.
5. Осадите ДНК, проведя центрифугирование в микрофуге в течение 2 с.
6. Слейте надосадочную жидкость. Сполосните осадок 70%-ным этанолом.
7. Слейте раствор, которым промывали осадок. Сухой осадок растворите в 10
мМ трис (pH 7,5) и 1 мМ Ыа2-ЭДТА.
8. Для длительного хранения повысьте концентрацию соли.
Б. 1. Смешайте фаг в растворе CsCl с плотностью, равной плавучей
плотности фага, 10 мМ MgS04, 10 мМ трис (pH 8), и 0,1 мМ Ыа2-ЭДТА с ]/ю
объема 0,2 М Ыа2-ЭДТА.
2. Диализуйте против 50% раствора формамида, 0,2 М трис (pH 8,5) и 0,02 М
Ыа2-ЭДТА при комнатной температуре в течение 12-24 ч.
3. Диализуйте- против буфера для хранения ДНК (0,1 М. NaCl, 0,05 М трис
(pH 8,5) и 0,01 М Ыа2-ЭДТА). Если будете расщеплять препарат ДНК
эндонуклеазой EcoRI, то диализуйте против 0,1 М NaCl, 0,05 М трис (pH
7,4) и 0,1 мМ Йа2-ЭДТА.
И. Выделение ДНК из фага К
83
4. Необходимо четыре раза сменять буфер в объеме, в 200 раз
превышающем объем диализуемого раствора.
Литература
Thomas М., Davis R. W., 1974. Studies on the cleavage of bacteriophage
lambda DNA with ?coRI restriction endonuclease, J. Mol. Biol, 91, 315.
St. John Т. (личное сообщение).
Обсуждение
Обычно ДНК фага К выделяют из препарата фага фенольной экстракцией,
проводя затем экстракцию эфиром, чтобы удалить растворенный фенол. Нами
обнаружено, что при использовании формамидного метода полученная ДНК
содержит меньше одноцепочечных разрывов и обладает большей инфекционно-
стью. Возможно, что при этом не удаляются фаговые белки, остающиеся в
виде "теней" бактериофага. Мы не наблюдали, однако, чтобы при
использовании таких препаратов ДНК каким-либо образом ингибировалась
работа большинства ферментов. По-видимому, при обработке формамидом ДНК
