Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
5°С.
3. Ресуспендируйте клетки в 1/4 объема 10 мМ трис (pH 8,5) и 1 мМ Ыа3-
ЭДТА. Вновь осадите клетки центрифугированием.
4. Ресуспендируйте клетки в 2 мл 15%-ного раствора сахарозы, 0,05 М трис
(pH 8,5) и 0,05 М Ыа2-ЭДТА, содержащего 1 мг/мл свежерастворенного
лизоцима. Перенесите в центрифужную пробирку на 10 мл, которую можно
центрифугировать при 20 000 об/мин. Инкубируйте при комнатной температуре
в течение 10-60 мин.
5. Добавьте 2 мл раствора тритона (0,1% тритона Х-100 (Sigma), 0,05 трис
(pH 8,5) и 0,05 М Ыа2-ЭДТА). Инкубируйте при комнатной температуре в
течение 10-20 мин. Если клетки не лизируют и суспензия не станет очень
вязкой, то инкубируйте 30 мин при 37°С.
6. Центрифугируйте в течение 1 ч в роторе JA-21 при 20 000 об/мин и 5°С.
7. Наклоняя пробирку, сливайте надосадочную жидкость в мерную
аналитическую пробирку до тех пор, пока не дойдете до очень вязкого
материала над осадком. Обычно этот вязкий материал занимает менее
последнего сантиметра осветленной надосадочной жидкости. Иногда
оказывается, что надосадоч-ная жидкость невязкая вся вплоть до самого
осадка. В таком случае соберите ее всю.
8. Доведите объем до 4,0 мл. Добавьте 3,7 г сухого CsCl и 0,4 мл раствора
10 мг/мл бромистого этидия (Sigma). Показатель преломления должен
находиться между 1,390 и 1,396, а плотность должна быть равна 1,59 г/мл.
Плотность является более надежным показателем и ее легко определить,
взвесив известный объем жидкости. Получившаяся в результате смесь как раз
заполнит одну пробирку от ротора SW50.1.
12. Выделение плазмидной и бактериальной ДНК
89
9. Центрифугируйте в течение 48 ч при 35 ООО об/мин и 20°С.
10. Если осветить пробирку длинноволновым УФ-светом, то можно увидеть
полосы. Нижняя полоса содержит ковалентно-замкнутую кольцевую ДНК-
Проткнув пробирку сбоку иглой номер 20 или 21 от шприца для инъекций,
отберите
ДНК.
Релаксированная ДНК; р = 1,55 г/мл Нативная суперализованная ДНК: р =
1,59 г/мл
При выделении из больших объемов культуры используйте угловые роторы или
роторы с вертикальным расположением пробирки.
Ротор
Объем культуры (л)
Число используемых пробирок
Раствор лизоцима (мл)
Раствор тритона (мл)
Надосадочная жидкость (мл)
CsCl (г)
Раствор бромистого этидия (мл)
50 Ti 60 Ti 60 Ti 60 Ti 60 Ti
0,1 0,8 1,5 3 6
1 1 2 4 8
4,5 13,5 27 54 108
4,8 14,5 29 58 116
8,7 27,5 55 110 220
8,3 26,13 52,26 104,5 209
0,9 2,75 5,5 11 22
Обсуждение
1. При длительном хранении на чашках, в столбиках или в бульоне клетки Е.
coli теряют многие плазмиды, даже муль-тикопийные. Поэтому целесообразно
непосредственно перед тем, как проводить выделение больших количеств
плазмидной ДНК, проверить присутствие плазмиды. Однако, чтобы
гарантировать поддержание плазмиды в этой культуре, не обязательно
выращивать культуру, из которой будете выделять плазмиду, в присутствии
используемого для отбора питательного вещества или лекарственного
препарата.
2. (Этапы 2 и 3); эти этапы нужны для того, чтобы отмыть клетки от
культуральной среды и других растворимых соединений (Mg2+, солей, буферов
и т. п.), которые могут мешать на следующих этапах.
3. (Этап 4); Ыа2-ЭДТА используется для удаления ионов Са2+ из клеточной
стенки, что делает ее более восприимчивой к действию лизоцима. Лизоцим
довольно неустойчив при щелочных значениях pH, и поэтому рекомендуется
пользоваться свежеприготовленным раствором. При pH 4-5 лизоцим стабилен в
течение нескольких недель при 5°С, а при комнатной температуре - в
течение нескольких дней. Этот фермент следует растворять в холодной
дистиллированной воде.
90
Раздел II, Методики
4. (Этап 5); тритон Х-100 представляет собой неионный детергент и
вызывает лизис обработанных лизоцимом клеток. При этом основная часть
клеточной ДНК остается связанной с обломками клеток и при
центрифугировании оказывается в осадке. Чтобы эта клеточная ДНК. не вышла
в раствор, нужно соблюдать осторожность и не слишком интенсивно
перемешивать.
5. (Этап 6); осадок получается несколько студенистым, а над-осадочная
жидкость - желтоватой. Если надосадочная жидкость оказывается прозрачной
и бесцветной, а осадок - компактным и непрозрачным, то значит, клетки не
лизиро-вали. Если получилось именно так, то ресуспендируйте осадок,
прогрейте пробирку в течение 30 мин при 65°С и повторите этап 6.
6. (Этап 7); плазмидная ДНК должна быть освобождена из обломков клеток и
должна находиться в надосадочной жидкости. Вязкий материал представляет
собой, по-видимому, клеточную ДНК- Желательно, чтобы его попало в
сливаемую жидкость как можно меньше.
7. (Этап 8); большинство препаратов CsCl влажные, и поэтому следует
установить эмпирическим путем, сколько добавлять невысушенного CsCl.
8. (Этап 9); при равновесном центрифугировании ДНК собирается в полосу
примерно за 48 ч. Однако, для того чтобы РНК достигла своей равновесной
полосы, необходимо больше времени. Поэтому чем дольше длится
центрифугирование, тем меньше в получаемом препарате ДНК оказывается
