Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
3. Добавьте эндонуклеазу и инкубируйте в течение 10 мин при 37°С. Проведя
электрофорез в геле, определите то количество фермента, которое дает
полное расщепление.
4. Повторите этап 3.
5. Прогрейте в течение 3 мин при 70°С, чтобы инактивировать эндонуклеазу
(см. приложение 7).
6. Если будете использовать эту ДНК Для упаковки in vitro, то инкубируйте
в течение 15 мин,при 50°С. Если же будете использовать ее в трансфекции,
то быстро охладите до 0°С.
96
Раздел II. Методики
П. Ковалентное соединение с помощью ДНК-лигазы фага Т4
]. Смешайте равные по весу количества ДНК вектора и встраиваемой ДНК-
2. Добавьте АТР до конечной концентрации 1 мМ.
3. Добавьте ДТТ до конечной концентрации 10 мМ.
4. На 1 мкг ДНК добавьте 0,1 ед. ДНК-лигазы фага Т4 или 0,1 мкл раствора
лигазы 1 мг/мл.
5. Инкубируйте в течение 1-6 ч при 0-10°С.
6. Под электронным микроскопом или с помощью электрофореза в геле
проверьте, произошло ли ковалентное соединение.
7. Проведите заражение этой ДНК или упакуйте ее.
Литература
Thomas М., Cameron 3. R" Davis R. W., 1974. Viable molecular hybrids of
bacteriophage lambda and eukaryotic DNA, Proc. Natl. Acad. Sci., 71,
4579.
Обсуждение
ДНК вектора и встраиваемую ДНК расщепляют по отдельности, так как важно
добиться такого расщепления векторной ДНК, чтобы нерасщепленной осталось
около одной молекулы ДНК фага X на 104 расщепленных молекул. Легко
получить препарат ДНК фага А, не загрязненный ингибиторами эндонуклеаз. В
то же время многие препараты клеточной ДНК содержат такие ингибиторы.
Если проводить совместное расщепление клеточной и фаговой ДНК, то
присутствие ингибитора в препарате клеточной ДНК приведет к тому, что
вероятность нерасщепленной ДНК фага X окажется выше, чем 10~4. Чтобы
получить заведомо полное расщепление, нужно брать эндонуклеазы- больше,
чем это было определено на этапе 3. Этот этап имеет существенное значение
только для векторной ДНК фага X. Присутствие 10~4 нерасщепленной ДНК фага
X нельзя обнаружить по результату электрофореза в геле, но легко выявить
по инфекционности. Для более высокой эффективности упаковки in vitro
липкие концы ДНК фага X должны быть соединены, а для более эффективной
трансфекции они должны оставаться свободными. Энергия активации
соединения липких концов ДНК фага X высока, и потому для их эффективного
соединения необходима высокая температура (50°С). При 0°С соединение
липких концов ДНК фага X происходит крайне медленно. Поэтому липкие
концы, образующиеся под действием рестриктирующей эндонуклеазы, можно
полностью соединить, не соединив в то же время липких концов ДНК фага X
(разд. II) .
15. Упаковка ДНК фага % в вирусные частицы in vitro
97
POISSON DISTRIBUTION
Основой флуктуациоиного теста Луриа-Дельбрюка служит знаменитое
распределение Пуассона (Poisson distribution) независимо от того,' имеют
ли дело с мутантами бактерий или с мутантами рыб [Genetics, 28, 491-511
(1943)]. Рыб разглядеть легче, но разложить их по ячейкам сложнее, если,
конечно, вы не птица.
Скорость соединения, катализируемого ДНК-лигазой фага Т4, прямо
пропорциональна концентрации лигазы. Поэтому используют высокие
концентрации этого фермента. При рекомендуемых концентрациях лигазы
реакция завершается за несколько минут. Рекомендуемых 1-6 ч хватает с
избытком, однако вреда этот избыток не причинит.
Методика 15
Упаковка ДНК фага Я в вирусные частицы in vitro
I. Упаковка
1. Возьмите 20 мкл индуцированных упаковывающих клеток, хранящихся при
-70°С.
98
Раздел II. Методики
2. Перенесите в лед для оттаивания (не нагрейте!).
3. После оттаивания добавьте 2 мкл 50 мМ АТР.
4. Добавьте <1 мкг ДНК в объеме 1 -10 мкл.
5. Осторожно перемешайте (клетки не должны лизировать).
6. Соберите жидкость на дно пробирки, проведя центрифугирование в
микрофуге в течение 3 с.
7. Инкубируйте при 37СС в течение 30-60 мин.
8. Добавьте 0,2 мкл раствора ДНКазы I с концентрацией 1 мг/мл.
9. Если нужна максимальная эффективность упаковки, то добавьте еще 20 мкл
оттаявшего экстракта и 2 мкл 50 мМ АТР (это увеличивает количество фага
примерно в два раза). Инкубируйте при 37°С еще в течение 30-;60 мин.
10. Добавьте 200 мкл буфера для разведения фага X и храните так же, как
препарат фага.
11. Высевайте не более 10-15 мкл такого препарата на чашку диаметром 9
см, используя для газона нерестриктирующий штамм RD104 (С600 hsdR~
hsclM+), не содержащий supF. Высев больших количеств препарата приведет к
гибели бактериального газона.
II. Получение индуцированных упаковывающих клеток
1. Штаммы бактерий
А: N 205 recA~ (Xirnm 434 cl-ts Ь2 red 3 Дат 4 Sam7)
Б: N 205 recA~ (Xirnm 434 cl-ts Ь2 red3 Dam4Sam7)
2. Рассейте каждый из этих штаммов штрихом до отдельных колоний. Чашки
инкубируйте при 25-30°С.
3. Проверьте рост нескольких колоний при 30 и 42°С.
4. С чашки, выращенной при 30°С, отберите уколом по одной такой колонии
этих штаммов, которая не растет при 42°С.
5. Суспендируйте колонию каждого из этих штаммов в 200 мл бульона LB
