Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
оранжевый являются мутагенами. В тесте Эймса 90 мкг бромистого этидия или
80 мкг акридинового оранжевого приводят к такому же результату, как
конденсат дыма от одной сигареты или 2 мкг нитрозогуанидина. Поэтому при
работе с их растворами надевайте перчатки.
А. Бромистый этидий
Бромистый этидий является интеркалирующим агентом и связывается с
двухцепочечной нуклеиновой кислотой. Ультрафиолетовый свет, поглощенный
бромистым этидием (300 нм) или ДНК (260 нм), но затем переданный
бромистому этидию, испускается в виде флуоресценции при 590 нм. Наилучшее
окрашивание получается, если перед проведением электрофореза нуклеиновых
кислот в гель и в электрофо-резный буфер внести бромистый этидий в
концентрации примерно 0,5 мкг/мл. Гель можно окрасить и после окончания
112
Раздел 11. Методики
электрофореза, вымочив его в . буфере с 0,5 мкг/мл бромистого этидия в
течение примерно 1 ч. В обоих случаях не обязательно проводить отмывку
геля от красителя. Можно прокрасить и одноцепочечную нуклеиновую кислоту.
Для этого нужно погрузить гель на 1 ч в 1 мМ MgS04 с 5 мкг/мл бромистого
этидия, а затем отмыть краситель в 1 мМ MgS04 в течение 1 ч.
Имеющийся в продаже бромистый этидий содержит много примесей (на долю
самого бромистого этидия приходится лишь около половины веса препарата).
Его концентрацию можно опредилить спектрофотометрически.
A4so=5700 М-1см-1, а молекулярная масса=394 г/моль.
Б. Акридиновый оранжевый
Акридиновый оранжевый может интеркалировать (встраиваться) в
двухцепочечную нуклеиновую кислоту, а может также и связываться с одно- и
двухцепочечной нуклеиновой кислотой, взаимодействуя электростатически с
ее фосфатными группами. Поглощаемый ультрафиолетовый свет с длиной волны
260 нм может испускаться в виде флуоресценции. При этом двухцепочечная
нуклеиновая кислота флуоресцирует при 530 нм (зеленый свет), а
одноцепочечная - при 640 нм (красный свет).
Гели окрашивают, выдерживая их в течение 1 ч в растворе 30 мкг/мл
акридинового оранжевого в 10 мМ растворе соли. Отмывают в течение 1 ч в
0,1 мМ растворе соли.
III. Фотографирование гелей, содержащих нуклеиновые кислоты
Многие красители, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами, флуоресцируют
при облучении УФ-светом. Такие красители, как бромистый этидий, обладают
плоской группой, которая может свободно вращаться, если краситель
находится в растворе. Если же краситель связан с ДНК, то вращение этой
группы оказывается заторможенным. В результате этого флуоресценция таких
красителей в связанном с нуклеиновой кислотой состоянии оказывается
гораздо выше, чем в растворе с низкой вязкостью. Нуклеиновая кислота
может поглощать ультрафиолетовый свет; эта энергия передастся на
краситель, а затем высветится в виде флуоресценции.
Максимальная чувствительность при фотографировании получается обычно при
облучении светом с длиной волны около 260 нм. Однако при таком облучении
быстро нарушается функциональная активность нуклеиновой кислоты (каждая
секунда облучения ДНК фага А снижает ее инфекционность на порядок).
20. Электрофорез в агарозном геле
113
Облучение же в течение нескольких минут светом с длиной волны 365 нм не
вызывает заметного снижения инфекционности нативной ДНК фага X (как с
бромистым этидием, так и без него), но приводит к образованию некоторого
количества поперечных сшивок.
A. Источник УФ-света
1. Источник с длиной волны 254 нм (TS36, UV Products).
2. Источник с длиной волны 300 нм (ТМ36, UV Products).
3.' Источник с длиной волны 365 нм (TL33, UV Products).
Б. Фильтры
1. Для УФ (контрастный фильтр J-344, UV Products).
2. Для флуоресценции бромистого этидия при 590 нм - желатиновый фильтр
23А, Kodak Wratten.
3. Для флуоресценции акридинового оранжевого при 530 нм и при 640 нм -
желатиновый фильтр 12 для флуоресценции в зеленой (от двухцепочечной) и
красной (от одноцепочечной нуклеиновой кислоты) областях спектра или
фильтр 40 только для зеленого, а фильтр 29 - только для красного света
(Kodak Wratten).
B. Фотоаппарат (Polaroid МР-4)
Г. Пленка (Polaroid 667 или 665)
Поскольку большинство фильтров флуоресцируют при УФ-облучении, to
контрастный УФ-фильтр всегда помеща'ют между источником УФ-света и
цветными фильтрами. При длительном облучении прозрачность для
ультрафиолета фильтра в источнике С61 снижается. Время полужизни такого
фильтра составляет примерно 20 ч. При длительном облучении, по-видимому,
портятся также и контрастный УФ-фильтр, и желатиновые фильтры, так что их
следует периодически заменять. При использовании источника С61 с новым
фильтром интенсивность света с длиной волны 230- 270 нм составляет 2400
мкВ/см2, а без фильтра 8500 мкВ/см2.
IV. Гели с глиоксалем
А. Приготовление образца
1. Если концентрация нуклеиновой кислоты в препарате достаточно высока,
то можно использовать непосредственно такой препарат. В противном случае
осадите нуклеиновую кислоту эталоном и ресуспендируйте в ГЬО.
2. В пробирке от микрофуги составьте пробу объемом 50 мкл: 25 мкл ДМСО
