Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
не растворяются при высокой концентрации NaC104 или KI-
2. Трис-фосфатный буфер. Тоже обладает высокой емкостью. При его
использовании получаются примерно такие же результаты, что и при
использовании трис-боратного буфера. Основной раствор, однако, может
зарастать. Его преимущество заключается в том, что такие гели можно
растворять в концентрированном растворе NaC104 или KI.
3. Трис-ацетатный буфер. Обладает относительно низкой буферной емкостью,
и при длительном электрофорезе может возникнуть необходимость в
рециркуляции буфера в аппарате. Использование при электрофорезе высоких
напряжений не вызывает нагрева. Исходные растворы могут зарастать. Гели в
трис-ацетатном буфере можно растворять в концентрированном NaClOi или KI.
Этот буфер, по-видимому, используется наиболее широко.
4. Щелочной буфер. Обладает очень низкой емкостью. Обычно при его
использовании необходима рециркуляция буфера в аппарате. Наносимые
образцы не должны содержать Mg2+, иначе ДНК выпадет в осадок. Ионы Mg2+
необходимо удалять, добавляя избыточные количества ЭДТА.
Б. Агароза
Препараты агарозы значительно различаются по твердости, по разрешающей
способности при разделении фрагментов ДНК, электрофоретической
подвижности ДНК, легкости плавления, прозрачности и наличию вредных
примесей. Наиболее вредной примесью являются, по-видимому, сульфони-
рованные агарозы, подавляющие активность многих фермен,-тов, работающих
на нуклеиновых кислотах.
Обычно мы пользуемся агарозой фирмы МС/В. Агарозу растворяют в буфере для
электрофореза, нагревая до кипения в микроволновой печи. Необходимо
убедиться, что рас-
110
Раздел 11. Методики
твор стал гомогенным и что в нем не осталось твердых частиц агарозы.
Перед тем как залить гель, раствор охлаждают до 50°С. Если заливать гель
слишком горячей агарозой, то легко можно повредить аппарат для
электрофореза
В. Лунки для образцов
Лунки для образцов делают с помощью погруженной в расплавленный гель
гребенки из оргстекла, полихлорвинила или тефлона. Гребенку устанавливают
до заливки геля таким образом, чтобы кончики зубьев находились примерно в
0,5 мм от основания геля. Если лунки достанут дна, то образец может
протечь под гель. Когда гель полностью застынет, гребенку вынимают и
лунки заполняют буфером для электрофореза.
Г. Нанесение образцов и краски
Наносимые образцы содержат 5-10% глицерола или 5- 10% сахарозы и 0,025%
красителя, благодаря которому можно проследить за ходом электрофореза.
Например, можно добавить в образец 7ю объема раствора, содержащего 50%
глицерола и 0,25% красителя.
ДНК¦ Наносите около 10 нг ДНК в расчете на каждую ожидаемую полосу. Гель
будет перегружен, если в полосе окажется более чем примерно 100 нг ДНК.
Краска
Бромфеноловый синий (распадается в щелочи). Вромкрезоловый зеленый
(обладает одинаковой подвижностью и в нейтральных, и в щелочных
растворах). Ксиленцианол FF (распадается в щелочи; подвижность ниже, чем
подвижность бромфенолового или бромкрезолового).
Образцы можно наносить, используя автоматическую пипетку и
полипропиленовый наконечник или с помощью микрошприца, на который надет
тонкий пластиковый шланг.
Подвижность небольших молекул ДНК может быть такой же или даже большей,
чем подвижность используемого красителя. Чем ниже концентрация агарозы и
(или) выше напряженность, тем больший фрагмент ДНК будет обладать такой
же подвижностью, как и краситель. Краситель поглощает флуоресценцию
связанного с ДНК бромистого этидия. Это приводит к тому, что в том месте
геля, где находится краска, невозможно наблюдать слабые полосы ДНК.
Образцы можно наносить и без краски.
Д. Напряженность
Обычно используют напряженность от 0,5 до 5 В/см. При небольшой
напряженности получается более высокое разре-
20. Электрофорез в агарозном геле
111
шение, особенно для высокомолекулярных ДНК (>70 kb). При электрофорезе
небольших молекул ДНК (<2kb), чтобы увеличить их подвижность и тем самым
снизить диффуз-ность полос, используют большую напряженность. Чаще всего
электрофорез проводят в 0,7%-ной агарозе при 1 В/см в трис-адетатном
буфере в течение примерно 12 ч.
Подвижность ДНК почти ё точности обратно пропорциональна логарифму длины
молекулы.
Длина дуплекса Концентрация агарозы, % Градиент напряжения, В/см
150-1000 1,8 2-3
300-2500 1,4 2-3
500-4000 1,0 1-2
700-6000 0,7 0,5-1
1000-9000 0,5 0,5-1
При электрофорезе в трис-ацетатном буфере с напряженностью 1 В/см краска
движется со скоростью около 1 см/ч.
Литература
McDonell М. W., Simon М. N., Studier F. W., 1977. Analysis of restriction
fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by
electrophoresis in neutral and alkaline gels, J. Mol. Biol., 110, 119.
Peacock A. C., Dingman C. W,, 1968. Molecular weight estimation and
separation of ribonucleic acid by electrophoresis in agarose-acrylamide
composite gels, Biochemistry, 7, 668.
II. Окрашивание ДНК в агарозных гелях
Предостережение. Бромистый этидий, продукты его метаболизма и акридиновый
