Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Девис Р. -> "Генетика бактерий " -> 35

Генетика бактерий - Девис Р.

Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий — М.: Мир, 1984. — 176 c.
Скачать (прямая ссылка): genetikabakteriy1984.djv
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 63 >> Следующая

примеси РНК-
9. (Этап 10); используется длинноволновый ультрафиолет, так как облучение
коротковолновым УФ-светом приводит к образованию в ДНК тиминовых димеров
и поперечных сшивок.
II.A. Быстрый метод выделения плазмидной и (или) бактериальной ДНК из
колоний или жидких культур
1. Пользуясь плоскими зубочистками, соскребите колонии с агарозных чашек
в центрифужные пробирки на 1,5 мл. Если исходите из жидкой культуры, то
отцентрифугируйте 0,1 мл культуры, выросшей до насыщения. Ресуспендируйте
осадок в 0,5 мл раствора:
50 мМ трис (pH 8,5),
50 мМ Ыаг-ЭДТА,
15% сахарозы,
1 мг/мл лизоцима (добавляется непосредственно перед использованием).
2. Оставьте на 10 мин при комнатной температуре.
12. Выделение плазмидной и бактериальной ДНК
91
3. Добавьте 1 мкл диэтилоксидиформата при комнатной температуре.
4. Добавьте 10 мкл 10%-ного раствора ДСН. Перемешайте, перевертывая
пробирку.
5. Для получения бактериальной ДНК прогрейте в течение 5 мин при 70°С под
крышкой. При выделении только плазмидной ДНК препарат не прогревайте.
6. Добавьте 50 мкл 5 М ацетата калия.
7. Охладите пробирки и держите их во льду в течение по крайней мере 30
мин.
8. Осадите преципитат центрифугированием в микрофуге в течение 15 мин.
9. Надосадочную жидкость слейте в новую пробирку.
10. Долейте пробирку доверху этиловым спиртом при комнат-' ной
температуре.
11. Осадите преципитат центрифугированием в микрофуге в течение 5 мин.
12. Слейте надосадочную жидкость. Переверните пробирку и поставьте ее на
бумажное полотенце, чтобы жидкость стекла из нее. Должна стечь вся
жидкость. Ее можно также выпарить, но нельзя пересушить осадок.
13. Растворите выпавшую в осадок ДНК в 50 мкл раствора:
10 мМ трис (pH 7,5),
1 мМ Ка3-ЭДТА,
10 мкг/мл РНКазы А.
Полученного количества ДНК обычно достаточно для двух нанесений на гель.
Суперспирализованную ДНК после этапа 13 можно прямо использовать для
электрофореза в геле. Все процедуры можно проводить при комнатной
температуре, за исключением этапа 7. На этом этапе необходима длительная
инкубация при 0°С, а также длительное центрифугирование, чтобы осадить
все обломки клеток и преципптат комплекса белка с додецилсульфатом калия.
Обсуждение
1. (Этапы 1 и 2); неочищенный агар сильно ингибирует активность
большинства рестриктирующих эндонуклеаз и других ферментов, работающих на
ДНК. Этим ингибитором, возможно, являются содержащиеся в нем
сульфонированные углеводороды. При соскребывании колоний с обычных чашек
с агаром иногда можно захватить столько этого ингибитора, что на
выделенной ДНК не смогут работать ферменты.
При использовании чашек с агарозой таких осложнений не возникает.. Не
обязательно использовать всю колонию. Обычно для выделения достаточно
примерно одной четверти колонии.
92
Раздел II. Методики
2. (Этап 3), диэтилоксидиформат добавляют, чтобы инактивировать нуклеазы.
Если нужна биологически активная ДНК, то этот этап следует опустить.
3. (Этап 4), ДСН лизирует сферопласты и денатурирует белки.
4. (Этап 5), при нагревании длинная бактериальная ДНК высвобождается из
других больших клеточных компонентов и уже не осаждается при
центрифугировании на этапе 8.
5. (Этап 6); ацетат калия используется для осаждения доде-цилсульфата и
комплексов белков с додецилсульфатом. Чтобы преципитаты образовывались
медленно, ацетат калия следует добавлять до того, как охлаждать пробирки.
6. (Этап 7); для полного осаждения додецилсульфата калия достаточно
охладить пробирки и держать их на холоду в течение 30 мин.
7. (Этап 8); если преципитат додецилсульфата калия образуется слишком
быстро, то он может оказаться хлопьевидным или захватить пузырьки
воздуха. В результате могут возникнуть трудности с его осаждением. Чтобы
полностью осадить додецилсульфат калия, достаточно центрифугирования в
течение 15 мин. Если же преципитат все-таки остался в над-осадочной
жидкости, то перенесите ее в новую пробирку, энергично встряхните и
повторите этац 8.
8. (Этап 9); не выбрасывайте преципитат. Если надосадочная жидкость
оказалась мутной, то просто повторите центрифугирование.
9. (Этапы 10 и 11); препарат содержит ДНК и РНК. Он легко осаждается
этиловым спиртом. Охлаждать препараты не следует, так как при пониженных
температурах может происходить преципитация нежелательных примесей.
10. (Этап 12); ацетат калия очень хорошо растворим в этаноле, так что
соль в осадок не выпадет. Чтобы удалить растворимые примеси и ацетат
калия, нужно слить всю жидкость. В этих же целях можно сполоснуть
пробирки 70%-ным этанолом. Если жидкость не стекает с пробирки, ее можно
промокнуть фитилем из ткани или ваты, не касаясь осадка ДНК.
11. (Этап 13); РНКазу используют, чтобы удалить примесь РНК, которая
может подавлять активность ферментов, работающих на ДНК- Гидролизованную
РНК удалять необязательно.
12. (Этап 14); иногда выделенная таким способом ДНК не расщепляется
рестриктирующими эндонуклеазами. В таком случае ее можно дополнительно
очистить, проведя второе осаждение этанолом. Добавьте 200 мкл 10 мМ трис
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 63 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed