Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
Mandel М., Higa A., 1970. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection,
J. Mol. Biol., 53, 159.
Методика 17
Субклонирование фрагментов ДНК в векторах-плазмидах Е. coli
1. В пробирке на 1,5 мл от микрофуги проведите полное расщепление
примерно 250 нг плазмидной ДНК (например, ДНК pBR322) соответствующей
эндонуклеазой (эндонуклеазами).
2. Добавьте 0,1 мкл или менее раствора щелочной фосфатазы из кишечника
теленка с концентрацией 1 мг/мл.
3. Инкубируйте в течение 15 мин при 37°С.
4. Добавьте равный объем перегнанного фенола, перемешайте в смесителе
Vortex. После этого отцентрифугируйте.
102
Раздел II. Методики
5. Отберите верхнюю водную фазу полипропиленовым наконечником пипетки и
перенесите ее в новую пробирку на 1,5 мл от микрофуги.
6. Добавьте около 0,1 мл насыщенного буфером эфира, перемешайте в
смесителе Vortex. Отцентрифугируйте и отбросьте верхнюю фазу (эфир).
7. Еще два раза повторите экстракцию эфиром.
8. Продуйте, чтобы удалить эфир.
9. ДНК, которую нужно клонировать, расщепите соответствующей
эндонуклеазой (эндонуклеазами). (Используйте такие количества ДНК, чтобы
фрагмента, который хотите встроить, оказалось около 50 нг.)
10. Фрагмент ДНК, который нужно субклонировать, можно выделить с помощью
электрофореза в агарозном геле (необязательно; см. методику 25).
11. Смешайте эквимолярные количества ДНК вектора и встраиваемой ДНК-
12. Добавьте АТР до конечной концентрации 1 мМ.
13. Добавьте ДТТ до конечной концентрации 10 мМ.
14. Добавьте 0,1 ед. лигазы фага Т4, или 0,1 мкл раствора с концентрацией
1 мг/мл.
15. Инкубируйте от 30 мин до 3 сут при 0-10°С.
16. Проведите трансфекцию клеток RD102 = HB101A.
17. 50 нг обработанной фосфатазой и лигазой ДНК одного лишь вектора
обычно приводят к образованию 0-10 колоний.
Литература
St. John Т. (личное сообщение).
Методика 18
Трансформация плазмидной ДНК
1. Разведите выращенную в бульоне LB ночную культуру штамма НВ101,
RD102 = HB101A или BNN45 в 100 раз в свежем бульоне LB (40 мл в колбе на
250 мл) при 37°С. Этого количества культуры достаточно для проведения 20
трансформаций.
18. Трансформация плазмидной ДНК
103
2. Когда плотность культуры достигнет Абоо = 0,6 (через 2-3 ч), осадите
клетки центрифугированием в течение 5 мин при 5000 об/мин и 2°С.
3. Ресуспендируйте в 20 мл 50 мМ СаС12 при 0°С и инкубируйте при 0°С в
течение 5-60 мин.
4. Осадите клетки центрифугированием в течение 2 мин при 5000 об/мин и
2°С. Ресуспендируйте в 2 мл 50 мМ СаСЬ при 0°С и инкубируйте при 0°С в
течение 5-60 мин.
5. Добавьте 0,1 мл клеток к ДНК в 0,1 М трис при pH 7,2 (0,09 М трис-НС1,
0,01 М трис-основание) и 0°С. Инкубируйте при 0°С в течение 10 мин.
6. Тепловая обработка: инкубируйте 2 мин при 37°С. Инкубация в течение 10
мин при комнатной температуре, 2 мин при 37°С и 10 мин при комнатной
температуре, 2 мин при 45°С и 10 мин при комнатной температуре или 2 мин
при 45°С приводит к одинаковому эффекту (в отличие от того, что
наблюдается в случае ДНК фага А,).
7. Добавьте 1 мл бульона LB и инкубируйте в течение 20 мин при 37°С.
8. Смешайте с 2,5 мл мягкого агара LB (без антибиотиков) при 47°С и
вылейте на чашку LB, содержащую тетрациклин (10 мкг/мл) или ампициллин
(50 мкг/мл, свежий раствор). Перед использованием чашки с тетрациклином
можно хранить при 10°С в течение нескольких недель. Чашки с ампициллином
можно хранить при 10°С перед их использованием
в течение нескольких дней.
При использовании клеток НВ101 или BNN45 эффективность составляет около
4-102 трансформантов на 1 нг ДНК формы I плазмиды pBR322 (при
использовании 5 нг ДНК на чашку).
Как для клеток НВ101, так и для клеток BNN45 насыщение при таких условиях
достигается при использовании от 50 до 100 нг ДНК на чашку.
Полученные под действием FcoRI линейные молекулы ДНК pBR322 являются, по-
видимому, неинфекционными для клеток НВ101 (фон в 0,3-0,5% может быть
обусловлен присутствием нерасщепленных молекул). Однако они инфекцион-ны
для клеток SF8 и дают на них трансформантов в количестве 2-3% от того,
что получается при использовании кольцевой замкнутой ДНК.
Литература
Mandel М., Higa А., 1970. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection,
J. Mol. Biol., 53, 159.
104
Раздел 11. Методики
Методика 19
Способность гибридного фага к комплементации в клетках Е. coli
I. Литический отбор из пула гибридов
1. Вырастите ауксотрофы до поздней экспоненциальной фазы в среде М9 +
0,2% мальтозы + необходимые пищевые добавки (40 мкг/мл каждой из
необходимых аминокислот). Определите концентрацию клеток.
2. Осадите клетки центрифугированием (8000 об/мин, 5 мин).
Ресуспендируйте в 1/10 объема 10 мМ MgS04 или в таком объеме, чтобы
получилось 1010 клетка/мл.
3. Адсорбируйте 2• 106 частиц фага (или менее) на 2-10Э клеток в течение
15 мин при 37°С. Эффективность высева комплемен-тирующего фага равна
примерно 1.
4. Смешайте с 2,5 мл мягкого (~0,6%-ного) агара М9 и высейте на чашку.
При 37°С для образования бляшек компле-ментирующего фага может
