Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Девис Р. -> "Генетика бактерий " -> 40

Генетика бактерий - Девис Р.

Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий — М.: Мир, 1984. — 176 c.
Скачать (прямая ссылка): genetikabakteriy1984.djv
Предыдущая << 1 .. 34 35 36 37 38 39 < 40 > 41 42 43 44 45 46 .. 63 >> Следующая

потребоваться 6-40 ч.
5. Проведите очистку бляшек на неселективной чашке (чашке LB) и повторно
проверьте комплементацию.
v
Обсуждение
1. При высоких концентрациях клеток часто подрастает газон" достаточный
для выявления бляшек. Можно добавить на чашку 10 мкг бромистого этидия и
выявлять бляшки, освещая чашку длинноволновым УФ-светом. При таких
высоких плотностях клеток рост фага все еще зависит от способности фага
комплементировать дефект бактерии-хозяина.
2. На чашку можно высевать до 107 фаговых частиц, и это не препятствует
выявлению случаев комплементации, которые возникают с низкой частотой.
Эффективность высева равна 1.
3. При необходимости можно, пользуясь стерильными миллипо-ровыми
фильтрами, сделать чашки-реплики. Бляшкам, способным к комплементации,
будут соответствовать большие зоны лизиса на газоне Е. coli дикого типа
после кратковременной инкубации таких чашек при 37°С.
4. Некомплементирующий фаг часто способен вырасти при длительной
инкубации и на бактериальных мутантах с неполным блоком. Тем не менее
иногда комплементирующие вирусы можно отличить по тому, что образуются
бляшки большего размера, или по тому, что они появляются раньше.
19. Комплементация гибридного фага в клетках Е. coli
105
5. Остерегайтесь размножения фага, обусловленного присутствием
ревергантов.
6. Комплементация может зависеть, а может и не зависеть от ориентации
гена. Гибридные фаги X, содержащие дрожжевую ДНК, комплементируют /г/хВ-
мутанты Е. coli, если последовательность his-3 дрожжевой ДНК
ориентирована таким образом, что может считываться с промотора Рь. Однако
клетки RD105 (Е. coli trpC9830) могут комплементироваться дрожжевой
последовательностью независимо от ее ориентации. Более того,
комплементация trpC может происходить и вообще в отсутствие Рц. Различия,
наблюдаемые в том, как комплементация зависит от ориентации гена,
могут_быть обусловлены как силой отбора (для литического развития фага X
необходим лишь очень незначительный синтез триптофана), так и
эффективностью экспрессии последовательности эукариотической ДНК.
Литература
Stinchcomb D. (личное сообщение).
II. Отбор из пула гибридов по двойным лизогенам
А. Отбор
1. Приготовьте препарат с высоким титром пула гибридного фага на
чашках, а также препарат фага - помощника интеграции (A,gt4-/ac5).
Препараты получайте на клетках, которые не могут расти на селективной
минимальной среде (BNN45). Вырастите до поздней экспоненциальной фазы
культуру ауксотрофа в 50 мл М9 + 0,2% мальтозы + необходимые пищевые
добавки (по 40 мкг/мл каждой из необходимых аминокислот). Определите
плотность культуры.
;3. Осадите клетки центрифугированием (8000 об/мин, 5 мин).
Ресуспендируйте в '/ю объема 10 мМ MgS04 или в таком объеме, чтобы
получилось 1010 клетка/мл.
4. Смешайте 5• 108 клеток с 2-109 частиц фага-помощника и 108 частиц
гибридного фага.
-5. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
Смешайте с 2,5 мл мягкого минимального агара М9 и вылейте на минимальную
чашку без питательного вещества, по которому ведется отбор.
7. Выращивайте при 32°С, так как фаг - помощник интеграции несет
температурочувствительную мутацию с1857 по респрес-сору. (Это занимает 1-
3 дня.)
106
Раздел II. Методики
8. Контрольные чашки: 1) клетки без фага, 2) фаг без клеток, 3) меньше
фага из пула гибридов (107 или 106 фаговых частиц) .
9. Уколом отберите каждую выросшую колонию и суспендируйте ее в 0,1-1,0
мл бульона LB.
10. Инкубируйте при 32°С до тех пор, пока культура не помутнеет (до
плотности 107-108 клетка/мл). После этого в течение по крайней мере 20
мин инкубируйте при 42°С..Продолжайте инкубировать при 37°С в течение 2
ч. Для полного лизиса добавьте каплю СНСЬ.
11. Штрихом рассейте получившийся лизат до отдельных бляшек на чашке LB с
газоном BNN45. В мягкий агар добавьте 40 мкл раствора Xgal с
концентрацией 40'мг/мл, чтобы выявить фаг - помощник интеграции Agt4-/ac5
(образует голубые бляшки).
12. Из бесцветных бляшек приготовьте на чашках препараты фага с высоким
титром.
13. Повторно проверьте комплементацию, начиная с этапа 4.
Б. Материалы*
1. Гибридный фаг: любой фаг att~.
Фаг-помощник: любой фаг att+int+ с функциональной гомологической
иммунностью, например фаг Xgt4-tac5.
2. Клетка: любой ауксотроф, на котором фаг X будет образовывать бляшки и
который может расти на минимальных средах с пищевыми добавками.
3. Чашки: М9,
Обсуждение
Большинство используемых для клонирования векторов X не содержит
функционально активного сайта прикрепления {аШ) или функционально
активного гена интеграции (int+). Поэтому они не могут образовывать
стабильных лизогенных бактерий. Можно, однако, использовать фаг-помощник,
способный к интеграции. После его интеграции гибридный фаг X может
встроиться уже в результате рекомбинации с гомологичными ему
последовательностями. Такие двойные лизогены образуются с частотой около
1%. Излечивание от них происходит довольно легко, но их можно
Предыдущая << 1 .. 34 35 36 37 38 39 < 40 > 41 42 43 44 45 46 .. 63 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed