Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
10. Если часть преципитата при центрифугировании не села на дно, то резко
встряхните пробирку, чтобы удалить захваченный преципитатом воздух, и
проведите повторное центрифугирование.
11. Постарайтесь не терять осадка. Если надосадочная жидкость оказалась
мутной, то проведите повторное центрифугирование.
12. Высокомолекулярная ДНК в полученном препарате легко осаждается
этанолом. Препарат не следует охлаждать, так
86
Раздел II. Методики
как при низких температурах могут выпасть в осадок и нежелательные
примеси.
13. (Этапы 13 и 14); ацетат калия очень хорошо растворим в этаноле, так
что соль в осадок не выпадает. Для удаления растворимых примесей и
ацетата калия важно, чтобы из пробирки стекла вся жидкость. Если жидкость
из пробирки не стекает, ее можно удалить тонким кончиком фитиля из
хлопчатобумажной ткани или ваты.
14. (Этап 15); РНКазу добавляют, чтобы удалить примесь РНК, которая может
ингибировать многие ферменты, работающие на ДНК- Расщепленную РНК можно
не удалять.
Литература
Cameron I. R., Philippsen P., Davis R. W" 1977. Analysis of chromosomal
integration and deletions of yeast plasmids, Nucleic Acids Res,. 4, 1429.
Ill, Выделение ДНК из термоиндуцибельных лизогенов 5am7
1. Рассейте лизогенные бактерии для получения отдельных колоний.
Инкубируйте при 30-32°С.
2. Проверьте несколько колоний на рост при 32 и 42°С.
3. Отберите с чашки, выращенной при 32°С, такую колонию, которая не
растет при 42°С. Вырастите ночную культуру в бульоне LB при 32°С.
4. Засейте 10 мл этой ночной культуры в 1000 мл бульона LB (pH 7,5-8).
5. Растите при 32°С до тех пор, пока А6оо не достигнет 0,6 (около 3-4 ч).
6. Нагрейте до 42-43°С и продолжайте выращивать при этой температуре в
течение по крайней мере 15 мин.
7. Выращивайте при 37°С в течение еще 3 ч (поддерживайте pH в пределах
7,5-8; если среда закисляется, то добавьте NaOH).
8. Добавьте 5 мл СНС13 и встряхивайте 10 мин при 37°С (лизис наступает
через несколько минут).
9. Центрифугируйте в роторе JA-7,5 (7000 об/мин, 5 мин), чтобы осадить
обломки клеток.
10. Осадите фаг центрифугированием в роторе JA-7,5 (7000 об/мин, 15 ч).
11. Осадок фага ресуспендируйте в 9 мл 4 М CsCl (р = 1,5), 10 мМ MgS04 и
0,1 мМ Ыа2-ЭДТА.
12. Заполните две пробирки от ротора Beckman SW50.1. Центрифугируя при 30
000 об/мин (20°С) в течение по крайней мере 16 ч, сконцентрируйте фаг в
полосу.
11. Выделение ДНК из фага X
87
13. Проколов пробирку сбоку иглой номер 25 от шприца для инъекций,
отберите полосу фага. Из каждой пробирки отбирайте 0,5 мл.
14. Храните фаг в растворе CsCl при 4°С. (При длительном хранении ДНК
лучше всего сохраняется в фаге.)
Хранение клеток. Вырастите ночную культуру при 32°С, добавьте
диметилсульфоксид до 7% (по объему), храните ее замороженной при -70°С.
IV. Разделение цепей ДНК фага X
А. Денатурирующий раствор
1. В полиалломерную пробирку от центрифуги Beckman размером 7гХ2 дюйма
при 0°С внесите 1,0 ед. А2бо фага X (50 мкг ДНК). (Максимальный объем 200
мкл; минимальное поглощение препарата А2бо = 5,0.)
2. Добавьте 200 мкл Н20 (минус объем фага).
3. Добавьте 5 мкл 1 М На4-ЭДТА.
4. Добавьте 5 мкл 4%-ного раствора N-лауроилсаркозината натрия в 10-2 М
трис (pH 7,5).
5. Добавьте 35 мкл 1 М NaOH.
6. Оставьте на 10-30 мин при комнатной температуре.
Б. Раствор для закаливания
1. Налейте 40 мкл 2М трис-HCl в пробирку от микрофуги на
1,5 мл.
2. Добавьте 1 ед. А26о poly(rUG) (например, 7 мкл раствора с А2бо = 175)
в Н20.
3. Добавьте 245 мкл Н20 (минус объем poly (rUG)). Суммарный объем
растворов А и Б равен 0,530 мл.
4. Поместить оба раствора (А и Б) в лед и охладите до 0°С. Пользуясь
автоматической пипеткой, впрысните раствор для закаливания (Б) и раствор
ДНК (А) в полиалломерной пробирке, помещенной в смеситель Vortex,
включенный на положение 3. Перенесите пробирку обратно в лед.
В. Добавьте 2,13 мл 7,29 М CsCl (р25=1,91; г)25= 1,4188).
Центрифугирование: 30 000 об/мин в роторе Beckman SW50.1 при 10°С в
течение 48 ч.
Фракционирование: фракции по 8 капель, всего 40 фракций. Литература
Davis R. W., Hyman R. W., 1971. A study in evolution: The DNA base
sequence homology between coliphages T1 and T3, J. Mol. Biol., 62, 287.
Summers W. C" Szybalski W" 1968. Totally asymmetric transcription of
coli-phage T7 in vivo: Correlation with polyG binding sites, Virology,
34, 9.
88
Раздел II. Методики
Методика 12
Выделение плазмидной и бактериальной ДНК
I. Выделение больших количеств плазмидной ДНК из Е. coli
1. Начинайте с отдельной колонии Е. coli, проверенной на наличие плазмиды
(TetR, AmpR, CamR и т. п.). В колбе на 1 л вырастите при интенсивном
встряхивании до насыщения 100 мл культуры в бульоне LB. Выход составляет
~;50 мкг. Приведенная ниже методика выделения рассчитана на одну пробирку
от ротора SW50.1. (Объемы при' использовании центрифужных пробирок для
других роторов, см. на стр. 89).
2. Осадите клетки центрифугированием в течение 5 мин при 8000 об/мин и
