Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Девис Р. -> "Генетика бактерий " -> 28

Генетика бактерий - Девис Р.

Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий — М.: Мир, 1984. — 176 c.
Скачать (прямая ссылка): genetikabakteriy1984.djv
Предыдущая << 1 .. 22 23 24 25 26 27 < 28 > 29 30 31 32 33 34 .. 63 >> Следующая

5. Каждую пробу оттитруйте на пермиссивных клетках-хозяе-вах. Через 24 ч
инкубации с гидроксиламином выживаемость упадет до нескольких процентов,
а в контрольных пробах она должна составлять 50-100%. Высевайте на чашки
несколько таких разведений, чтобы образовалось 1000-3000 бляшек. Эти
чашки можно будет использовать для определения частоты прозрачных бляшек.
Разведения стабильнее, чем пробы в LBSE, так что оставьте разведения на
холоду, чтобы потом можно было высеять их на много чашек.
6. Выделите мутантов фага. Для этого высейте на чашки с пер-миссивным
хозяином подходящие разведения (чтобы получилось - 100 бляшек на чашке).
Уколом стерильными зубочистками отберите бляшки со свежих чашек (<18 ч) и
переколите их на чашки с непермиссивным и пермиссивньш хозяином (т. е. на
свежеприготовленные чашки с соответствующими бактериями, высеянными в
верхнем агаре). Часто оказывается желательным стерилизовать газон перед
тем, как уколом отбирать чашки. Для этого чашку держат в течение примерно
10 мин в перевернутом виде над ванночкой с хлороформом.
II. Локализованный мутагенез (по котрансдукции)
1. Смешайте 1 мл буфера фосфат-ЭДТА, 1,5 мл стерильной воды, 2 мл
гидроксиламина и 0,5 мл фага Р22 (2-1011-
74
Раздел //. Методики
2• 1012 БОЕ/мл), выращенного на донорном штамме с каким-нибудь маркером,
по которому можно проводить отбор и который сцеплен с той областью, в
которой намереваетесь специфически получать мутации (Hong and Ames,
1971).
2. Инкубируйте при 37°С в течение 20-50 ч.
3. Периодически (через каждые 6-8 ч) отбирайте пробы, разводя их в
холодной среде LBSE.
4. Сразу же титруйте эти пробы, чтобы определить выживаемость и частоту
мутаций, приводящих к прозрачным бляшкам (см. обсуждение).
5. Примерно через 30-50 ч (или когда выживаемость составит около 0,1-1%)
отцентрифугируйте смесь в роторе Sorvall в течение 2 ч при 1700 об/мин,
чтобы осадить .фаг. Ресуспенди-руйте осадок в 1 мл среды LBSE, просто
залив его на ночь (периодически встряхивая). (Не разбивайте осадок с
помощью пипетки.)
6. Для трансдукции высейте около 0,1 мл мутагенизирован-ного фага и 108
бактерий на чашку. Чашки должны быть со средой, которая является
селективной для используемого селектируемого сцепленного маркера
(например, TetK). Когда появятся колонии, их нужно перепечатать на чашки-
реплики, чтобы выявить мутантов, несущих мутации, сцепленные с
селектируемым маркером (например, Тп70).
Литература
Hong J.-S., Ames В. N., 1971. Localized mutagenesis of any specific small
region of the bacterial chromosome, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 68, 3158.
Обсуждение
Гидроксиламин является мощным мутагеном, который можно использовать для
обработки in vitro ДНК или ДНК-содержа-щих вирусов. Достоинство этого
соединения состоит в том, что известны его механизм действия и
специфичность. Он вызывает исключительно транзиции G-кА. При правильном
его применении получается очень высокое отношение мутаций к леталям.
Поэтому им пользуются в тех случаях, когда возникает необходимость в
сильном мутагенезе (например, при локализованном мутагенезе). Кроме того,
следует иметь в виду, что тяжелый химический мутагенез часто приводит к
образованию множественных мутаций. При работе с умеренными фагами степень
мутагенеза удобно определять, выявляя среди выживших фагов мутантов,
дающих прозрачные бляшки; имеет смысл следить за количеством мутантов,
образующих прозрачные бляшки, даже в экспериментах по локализованному
мутагенезу, так как просто
9. Отбор делеционных мутантов фага X
75
по выживаемости степень мутагенеза надежно установить . нельзя.
I. А. В случае фага Р22 MgCl2 можно заменить на стерильную
воду. Фаги X (особенно те, у которых геном больше обычного) чувствительны
к ЭДТА, и потому нужно добавлять MgCl2. На холоду небольшое количество
ЭДТА в среде LBSE не оказывает сильного влияния на выживаемость; при
разведении в два раза в среде для разведения фагаХ активность ионов Mg2+
восстанавливается.
Б. В тех случаях, когда мутагеном обрабатывают с+-фаг, полезно определить
частоту мутаций, приводящих к появлению прозрачных бляшек. Прозрачные
бляшки выявляются даже на таких чашках, которые довольно плотно заполнены
бляшками. При максимально возможном мутагенезе прозрачными оказывается
около 5% бляшек.
В. Обычная схема выделения амбер-мутаций в генах фага включает высев
мутагенизированного фага на чашку с газоном su+ при 30°С и перекалывание
образовавшихся бляшек на три чашки: с газоном su~ (которую инкубируют при
40°С), с газоном su+ (которую инкубируют при 40°С) и еще на одну чашку с
газоном su+ (которую инкубируют при 30°С). Следуя такой схеме, можно
выделить и амбер-мутантов, и температурочувствительных мутантов.
II. А. Важно провести очистку новых мутантов как можно
раньше, чтобы освободить их от фаговых частиц. В случае фага Р22
добавление ЭГТА в среду, используемую для идентификации мутантов, повысит
вероятность выделения чувствительных к фагу нелизогенных мутантов.
Предыдущая << 1 .. 22 23 24 25 26 27 < 28 > 29 30 31 32 33 34 .. 63 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed