Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
Б. См. выше 1-Б.
Литература
Hall D. Н., Tessman /., 1966. Т4 mutants unable to induce deoxycytidylate
deaminase activity, ViTology, 29, 339.
Parkinson J. S., 1968. Genetics of the left arm of the chromosome of
bacteriophage iambda, Genetics, 59, 311.
Методика 9
Отбор делеционных мутантов фага X
1. Получите на чашках препарат чувствительного к ЭДТА фага (см.
обсуждение). Фаг элюируйте из агара раствором для
76
Раздел II. Методики
разведения фага X без магния. Можно также развести обычный препарат фага
в 5 раз средой для разведения фага Я без магния.
2. Разведите такой препарат фага, содержащий мало магния, в 10 мМ ЭДТА
(pH 7). Если титр фага в препарате оказался слишком низким, чтобы его
можно было разводить (ниже, чем 1010 частица/мл), то можно просто
добавить в него ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ, учитывая при этом,
конечно, содержание Mg2+ в препарате.
3. Инкубируйте в течение 30 мин при 48°С. Титр фага должен упасть в 104-
105 раз. Если отбираются более протяженные делеции или если отбираются
делеции среди малочувствительных препаратов фага, то инкубировать вдожно
и при более высокой температуре.
4. Из обработанного препарата (содержащего не менее 105 частица/мл)
отберите 0,1 мл и используйте этот объем для получения нового препарата
фага на чашке. В методике 2 описано, как это сделать. Пользуйтесь чашками
для фага X.
5. Полученный новый препарат фага опять прогрейте с ЭДТА, как это
делалось на этапах 1-3. Титр должен упасть не более чем в 103 раз.
6. Суспензию фага, прошедшего повторную обработку, высейте для получения
отдельных бляшек. Их можно переколоть и каждую по отдельности проверить
на наличие мутаций (как описано в методике 8). Можно также высеять
суспензию на индикаторные чашки, которые позволяют прямо идентифицировать
мутантов (например, на чашки Red, как это описано в методике 7).
Обсуждение
Для поддержания структурной целостности головки фага X необходимы ионы
магния. Удаление их хелатирующими соединениями, например ЭДТА или
пирофосфатом, приводит к разрушению тех головок фага X, в которых
содержание ДНК больше, чем 96% от содержания ДНК в фаге дикого типа.
Поэтому, действуя хелатирующими соединениями на препараты фага X, можно
отобрать из них естественно возникающие там делеции. Обычно для этого
необходимо провести несколько циклов отбора, так как в любой популяции
присутствуют природные варианты фага X (X*), устойчивые к хелатирующим
соединениям не потому, что они содержат меньше ДНК, а по другим причинам
(возможно, потому, что у них повышено содержание белка). Обычно при этих
последующих циклах проводят высев на чашки с хелатирующим соединением.
Более подробно об этой методике см. в работе Паркинсона и Хаски
(Parkinson and Huskey, 1971). Необходимо начать работу с фага, геном
10. Тесты на рекомбинацию и комплементацию фага in vivo
77
которого достаточно велик, чтобы он был чувствителен к таким хелатирующим
соединениям, как ЭДТА. Проще всего определить это эмпирическим путем с
помощью чашек с ЭДТА. Чтобы проверить фаг, нанесите его штрихом на газон
Е. coli на чашке с триптиказой и ЭДТА (1 мМ). (В зависимости от партии
триптиказы или агара необходимая концентрация ЭДТА может варьировать.)
Используйте верхний агар также с триптиказой и ЭДТА. Параллельно с такой
проверкой фага на среде с ЭДТА нанесите фаг штрихом и на обычные чашки
для фага X с верхним агаром для этого фага. На каждую чашку нанесите и
штрихи контрольных фагов Х+ (дикийтип), и X с1857 6515 6519 ninS intam29.
Сравните размеры бляшек, появившихся после инкубации в течение ночи при
42°С. Чувствительный к ЭДТА фаг образует крошечные бляшки (или вообще не
образует их). Важно проводить проверку именно путем рассева до отдельных
бляшек, так как на основании спот-теста надежных выводов сделать нельзя.
Литература
Parkinson J. S., Huskey R. J1971. Deletion mutants of bacteriophage
lambda. Isolation and initial characterization, J. Mol. Biol., 56, 369.
Методика 10
Тесты на рекомбинацию и комплементацию фага in vivo
I. Стандартное скрещивание (для определения частоты рекомбинации или
для создания рекомбинанта)
1. Вырастите ночную культуру бактериального штамма, пер-миссивного для
обоих фагов, которые вы будете скрещивать. Определите точный титр каждого
из этих фагов (методика 1).
2. Разведите культуру 7юоо в среде TYM (если скрещиваете
фаги X) или в среде LB (если скрещиваете фаги Р22) и под-
растите культуру до плотности не выше, чем 2-108 клетка/мл
(по Клетту, это 40; можно пользоваться также камерой Пет-
рова - Хауссера).
78
Раздел II. Методики
3. Осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте их в холодной
среде для разведения фага X (если скрещиваете фаги Я) или в забуференном
физиологическом растворе (если скрещиваете фаги Р22). Ресуспендируйте
таким образом, чтобы получилась плотность 4 • 10s клетка/мл.
4. Каждый из родительских фагов разведите до титра 4-109 фаг/мл. Смешайте
их вместе в соотношении 1:1.
